背景:食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,是全球第六大癌症相关死因。食管癌病理分为食管鳞癌和腺癌。食管腺癌在北美和西欧较为常见,食管鳞癌是亚洲最常见的病理类型,预后较差。目前的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗。食管癌早期症状不明显,约有30-50%的患者在确诊时丧失手术机会,多采取以放疗为主的综合治疗。随着放疗技术和药物的发展,食管癌的生存有所提高,但总体5年生存率仍较低。治疗失败的主要原因包括局部未控和复发,肿瘤细胞的放射抵抗是影响放疗疗效的主要生物学因素之一。因此寻找新的治疗方式或者药物,特别是放疗增敏剂来增加ESCC放射敏感性提高放疗疗效已成为当务之急,也是放疗界研究的热点。射线通过损伤DNA,诱导肿瘤细胞出现凋亡、坏死,是射线杀伤肿瘤的主要机制之一,但由于DNA修复途径的激活和凋亡抵抗而出现辐射抵抗。因此,通过其他非凋亡死亡途径使癌细胞对射线敏感,对肿瘤治疗有很大价值。铁死亡,一种铁离子依赖的、致死性脂质过氧化物堆积、浆膜上多不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸磷脂耗尽为特点的调节性死亡,可以被GPX4,Nrf2,TFR1,SLC7A11等关键基因调节。最近研究发现,放射可诱导人纤维肉瘤HT1080细胞、肺腺癌细胞发生铁死亡,但在这两种肿瘤细胞中放射诱导细胞发生铁死亡的分子机制却完全不同。在人纤维肉瘤HT1080细胞中放射通过激活ATM,抑制SLC7A11蛋白表达,限制细胞摄取胱氨酸并减少谷胱甘肽合成,增加脂质过氧化损伤介导铁死亡。在肺癌细胞系H460、A549中,其机制为放射诱导ACSL4蛋白表达,导致脂质过氧化物堆积来促进铁死亡,且放射后出现SLC7A11、GPX4蛋白表达增高,发生负反馈调节,促进肿瘤细胞生存。同时有研究发现经放射后,MCF-7和UMRC6细胞系中不能检测到铁死亡标志基因PTGS2表达增加。用铁死亡诱导剂处理860种肿瘤细胞系,发现不同细胞对于铁死亡诱导剂的的敏感性有很大差异。SLC7A11为溶质载体家族成员之一,作为跨膜蛋白介导胱氨酸入胞,参与GSH合成,保护细胞免受氧化应激损伤。SLC7A11是铁死亡通路中的关键基因,通过参与GSH合成、脂质过氧化物的氧化还原调控铁死亡。抑制SLC7A11可以触发铁死亡。SLC7A11广泛高表达于肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤,在肿瘤的发生、发展和侵袭转移中发挥重要作用。ATF3是ATF/CREB转录因子家族中的一员,是一个已知的氧化应激反应基因。其表达可被多种细胞应激迅速诱导,包括DNA损伤、氧化应激和细胞损伤。目前仅在人纤维肉瘤HT1080细胞中发现ATF3通过与转录激活因子竞争BS-1/BS-2的结合来抑制SLC7A11启动子,抑制SLC7A11蛋白表达,在Erastin诱导HT1080细胞铁死亡中发挥作用。目前铁死亡在放射介导的ESCC细胞死亡中作用不明确,具体的分子机制不清楚,通过靶向铁死亡通路,增加ESCC细胞放射敏感性,改善食管癌预后具有很大的研究价值。本研究将从细胞、代谢、分子水平多角度去验证放射可以诱导食管鳞癌细胞发生铁死亡,通过系列实验探索和证明放射是通过上调ATF3表达来抑制SLC7A11表达,介导ESCC细胞铁死亡;并验证靶向SLC7A11的铁死亡诱导剂对ESCC细胞具有放射增敏作用。为深入了解放射诱发铁死亡的机制,和靶向铁死亡增加食管鳞癌放射敏感性提供理论依据,促进肿瘤的个体化和精准治疗。目的:1、证明放射可诱导食管鳞癌细胞发生铁死亡;2、证明放射是通过上调ATF3表达来抑制SLC7A11表达,介导ESCC细胞铁死亡;3、证明靶向SLC7A11的铁死亡诱导剂可作为潜在的放射增敏剂;4、验证食管鳞癌病理样本中ATF3与SLC7A11蛋白表达相关性、与放疗预后关系。方法:1、在含有ESCC细胞系KYSE150、TE1细胞的培养孔中加入铁死亡抑制剂（Ferr-1、Lipr-1、DFO）、凋亡抑制剂（V-ZAD）、坏死抑制剂（Necr-1）后给予照射、培养一定时间后使用CCK-8检测细胞活性,计算不同死亡抑制剂对放射后细胞活性的影响,反映铁死亡、凋亡、坏死在放射后细胞死亡中所占比例;并通过铁死亡抑制剂联合照射后克隆形成实验再次验证。2、通过C11-Bodipy染色、流式技术检测细胞中脂质ROS水平变化、谷胱甘肽检测试剂盒检测照射前后、基因干扰ATF3、SLC7A11蛋白表达的细胞中总GSH水平变化。3、通过real-time PCR、Western blot检测放射后食管鳞癌细胞KYSE150、TE1中铁死亡关键基因PTGS2、SLC7A11、GPX4、ACSL4、LPCAT3等基因变化、SLC7A11上游转录因子Nrf2、ATF4、TP53、ATF3基因变化,探索放射诱导食管鳞癌铁死亡潜在的分子机制。4、通过慢病毒干扰SLC7A11表达构建KYSE150-过表达SLC7A11细胞、TE1-沉默SLC7A11细胞稳定株,Western blot进行蛋白水平验证、并检测干扰SLC7A11表达后对放射诱导的DNA损伤修复的影响。使用铁死亡抑制剂处理KYSE150-过表达SLC7A11、TE1-沉默SLC7A11细胞,CCK8法检测两种细胞系放射后铁死亡比例变化,并用克隆形成实验再次验证,来证明SLC7A11表达下降是放射诱导食管鳞癌细胞发生铁死亡的重要因素。5、使用小干扰RNA下调食管鳞癌KYSE150、TE1细胞系中ATF3的表达、72h后Western blot进行ATF3干扰效率及对SLC7A11表达影响。然后对下调ATF3表达的细胞系进行照射,Western blot检测照射后ATF3、SLC7A11表达较NC组的变化、对DNA损伤修复的影响。使用铁死亡抑制剂处理下调ATF3表达的细胞系,使用CCK8检测其放射后细胞铁死亡比例变化,并用克隆形成再次验证。由此来证明ATF3对SLC7A11蛋白表达的调控,及对放射后ESCC细胞铁死亡、放射敏感性的影响。6、应用CCK8检测药物毒性,得到KYSE150、TE1细胞系中靶向SLC7A11的铁死亡诱导剂Erastin、SAS 24h、48h、72h的IC50浓度,选择合适药物浓度联合放射进行克隆形成验证铁死亡诱导剂可作为食管鳞癌潜在的放射增敏剂。7、收集2014年1月至2018年7月于中国医大一院行根治性放疗的食管鳞癌患者临床资料、随访信息;采用SP免疫组化方法检其放疗前食管鳞癌病理组织中ATF3、SLC7A11表达情况,按染色评分分高、低表达组,并进行相关性和预后分析。结果:1、放射后ESCC细胞内脂质ROS水平升高放射后ESCC细胞系KYSE150、TE1细胞中脂质过氧化物水平随着照射剂量增加而增多。KYSE150细胞中8Gy/72h组较未照射组增加1.322倍,TE1细胞中8Gy/72h组较未照射增加1.559倍,P值均＜0.05,差异具有统计学意义;2、铁死亡抑制剂部分逆转放射诱导细胞死亡CCK8检测结果显示,与单纯照射组相比,使用铁死亡抑制剂Ferr-1,DFO均增加放射后KYSE150、TE1细胞的活率（P＜0.05）。克隆形成实验表明在两种细胞系中,Ferr-1+IR组、lipr-1+IR组的SF分数较单纯IR组增加,提示铁死亡抑制剂可以部分逆转放射诱导的细胞死亡。3、放射后细胞内铁死亡标志基因PTGS2表达增加应用Real-time PCR技术检测ESCC细胞系KYSE150、TE1中铁死亡标志基因PTGS2变化,结果显示KYSE150、TE1细胞经照射后PTGS2 m RNA水平显著增高（P＜0.05）。4、放射后ESCC细胞内SLC7A11表达水平下降,细胞内GSH水平下降应用Real-time PCR和Western blot技术检测放射后KYSE150、TE1细胞中铁死亡通路关键基因SLC7A11、ACSL4、GPX4等表达变化,结果显示SLC7A11表达下降,而ACSL4、GPX4在两个细胞系中未检测出一致变化。GSH检测结果显示KYSE150、TE1细胞中经照射8Gy后GSH水平逐渐下降（P＜0.05）。提示放射后SLC7A11蛋白水平下降可能是ESCC细胞铁死亡的关键因素。5、沉默SLC7A11表达可增加放射诱导的ESCC细胞铁死亡,过表达SLC7A11部分逆转放射诱导的ESCC铁死亡5.1使用慢病毒干扰SLC7A11表达,成功构建KYSE150-过表达SLC7A11和TE1-沉默SLC7A11细胞系。GSH和脂质ROS水平检测显示,对比NC组,过表达SLC7A11后照射后细胞内GSH水平增加、脂质ROS水平下降,沉默SLC7A11后出现相反结果。5.2过表达SLC7A11后,细胞照射后克隆形成率增加（P＜0.05）,铁死亡抑制剂挽救照射所致细胞死亡比例下降（P＜0.05）。提示过表达SLC7A11部分逆转了KYSE150放疗后细胞铁死亡。沉默SLC7A11后,细胞增殖能力有下降,放射后克隆形成率减少,TE1细胞放射敏感性增加（P＜0.05）。CCK8检测结果显示,沉默SLC7A11可降低照射后细胞活率,铁死亡抑制剂挽救照射所致细胞死亡比例增加,P＜0.05。提示沉默SLC7A11增加放射诱导的铁死亡。5.3过表达SLC7A11不会影响照射后γ-H2AX（p-s139）蛋白水平,即DNA损伤修复不受影响。沉默SLC7A11后照射后γ-H2AX（p-s139）水平增加,提示DNA损伤修复水平下降。提示沉默SLC7A11通过影响细胞增殖、铁死亡和DNA损伤修复三方面增加放射敏感性,是极具潜力的调控靶点。6、放射后KYSE150、TE1细胞中ATF3表达增加本研究对调控SLC7A11表达的上游转录子TP53、NRF2、ATF3、ATF4的放射后m RNA水平进行检测,结果显示TP53、NRF2未见明显变化,ATF4在两种ESCC细胞系中不一致,可能不是SLC7A11变化的关键因素,而ATF3在两种ESCC细胞系中表现出一致的放射后m RNA水平显著增加。Western blot在蛋白水平进行验证发现ATF3蛋白表达在放射后显著增加,与SLC7A11蛋白水平相反。提示放射后ESCC细胞中ATF3表达增高可能是抑制SLC7A11表达的上游因子。7、下调ATF3表达部分逆转放射后SLC7A11表达下降,对DNA损伤修复无影响使用小干扰RNA下调ATF3表达,Western blot检测证实下调ATF3表达后,两种细胞系中SLC7A11表达增加,既往放射诱导ATF3表达增加、SLC7A11表达下降这一现象被逆转。下调ATF3表达的细胞在放射后不在出现ATF3表达升高、相应的SLC7A11表达下降部分恢复,经照射后细胞内γ-H2AX（p-s139）蛋白水平未见变化,提示放射后的DNA损伤修复不受影响。8、下调ATF3表达后部分逆转放射后细胞铁死亡克隆形成实验显示下调ATF3表达对KYSE150和TE1细胞增殖无影响,经放射后克隆形成率增加,放射诱导的细胞死亡比率下降（P＜0.05）。CCK8检测结果表明,下调ATF3表达可增加照射后细胞的活率,铁死亡抑制剂挽救照射所致细胞死亡能力下降。表明下调ATF3表达后放射诱导的铁死亡比例下降（P＜0.05）。与对照组相比,下调ATF3表达后,IR后细胞内GSH水平增加、脂质ROS水平下降。与前文过表达SLC7A11结果相似。9、靶向SLC7A11的铁死亡诱导剂增加ESCC细胞放射敏感性应用CCK8检测靶向SLC7A11的铁死亡诱导剂Erastin、SAS对食管鳞癌细胞系KYSE150、TE1细胞系中24h、48h、72h的IC50浓度。选择适当药物浓度（Erastin 5u M、SAS 500u M）作用于两种细胞系,给予0、2、4、6、8Gy照射后计算细胞克隆形成率。采用单击多靶模型拟合曲线,多重t检验计算,结果表明Erastin、SAS可以增加ESCC细胞放射敏感性（P＜0.05）。10、SLC7A11与ATF3表达呈负相关,是食管鳞癌患者放疗后独立预后因素免疫组化检测结果显示SLC7A11蛋白表达定位于细胞膜和胞浆中,ATF3表达主要定位在胞浆和少数细胞核,两者表达呈负相关,r=-0.1918,P=0.0125,差异具有统计学意义。SLC7A11、ATF3蛋白表达与性别、年龄、肿瘤位置、长度、临床分期等均无密切关系。SLC7A11低表达组预后好,ATF3低表达组预后差;联合预测显示,仅有ATF3高表达患者预后最佳,仅SLC7A11高表达组预后最差,P＜0.05,差异具有统计学意义。COX分析结果表明SLC7A11表达、ATF3表达、T分期是食管鳞癌患者放疗后独立预后因素。结论:1、放射诱发食管鳞癌细胞发生铁死亡;2、放射后SLC7A11表达下降是发生铁死亡的重要因素;3、下调SLC7A11表达通过促进铁死亡、抑制增殖、影响DNA损伤修复共同增加放射敏感性,是极具潜力的调控靶点;上调SLC7A11表达可部分逆转铁死亡,不影响增殖、DNA损伤修复;4、放射后ATF3表达增加,下调ATF3后,SLC7A11表达增加,部分逆转放射后铁死亡,不影响增殖和DNA损伤修复;5、放射上调ATF3抑制SLC7A11表达是ESCC细胞发生铁死亡的分子机制;6、靶向SLC7A11的铁死亡诱导剂可增加ESCC细胞放射敏感性;7、SLC7A11与ATF3在ESCC病理样本的表达呈负相关,是ESCC患者放疗后独立预后因素。