大肠杆菌作为特性最好的宿主细胞之一，具有生长周期短，培养成本低，适合工业化生产等特点，现已被广泛用作生产异源蛋白的细胞工厂。异源蛋白在大肠杆菌中的表达可分为胞内表达和胞外分泌两种类型，胞外分泌异源蛋白的生产策略避免了蛋白提取过程中的细胞裂解等步骤，因此比胞内生产操作更简单，生产费用更低，在工业化生产中是首选方案。大肠杆菌蛋白质分泌到细胞外通常是在信号肽的引导下将蛋白质定向到特定的分泌途径中，然而在大肠杆菌中存在一种由超折叠荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein sfGFP)介导的分泌系统(E.coli sfGFP mediated Protein Secretion System EGPSS)，在该系统中sfGFP可以在不影响融合蛋白构象和功能的情况下，引导重组蛋白分泌至胞外，同时提高融合蛋白的可溶性。但EGPSS的具体分泌途径及其机制尚未明确。
　　为了进一步提高可溶性绿色荧光蛋白(Soluble Green Fluorescent Protein sGFP)在大肠杆菌中的自分泌水平，探讨膜蛋白在EGPSS分泌系统中的可能作用，同时为后期提高与sGFP融合蛋白分泌性表达实验提供依据，本研究首先对Red重组系统辅助质粒pKD46中的启动子进行改造，用热休克启动子Phs替换原有化学诱导启动子,以消除pKD46质粒在大肠杆菌Red重组过程中存在的限制，即简化实验操作步骤，并提高外源基因(或DNA片段)在大肠杆菌染色体定点整合相关蛋白诱导表达的精确性及有效性，改造后的Red重组系统辅助质粒为pKD-Phs。随后，通过改造后的Red重组系统，用sGFP串联卡那霉素(Kan)双基因表达盒(sGFP-Kan)替换大肠杆菌染色体上编码细胞外膜脂蛋白的lpp基因位点(即同时敲除lpp基因)，构建突变菌株BL21(DE3)Δlpp∷sGFP。然后确定该突变菌株BL21(DE3)Δlpp∷sGFP和pET29b-sGFP转化菌株BL21(DE3)的最佳诱导时间。在最佳诱导时间，进行sGFP分泌水平的分析，确定lpp基因敲除对sGFP分泌的影响。
　　结果表明，热休克启动子在大肠杆菌中虽然诱导基因表达的效率略低于T7启动子，但其仍具有较高的诱导基因表达的功能，可用于改造Red重组辅助质粒。通过sGFP-Kan表达盒替换并敲除大肠杆菌lpp基因，成功获得了突变菌株BL21(DE3)Δlpp∷sGFP，其具有遗传稳定性，同时lpp基因的敲除对大肠杆菌的生长周期影响较小，突变菌株与野生菌株生长曲线相似。突变菌株BL21(DE3)Δlpp∷sGFP和pET29b-sGFP转化菌株BL21(DE3)的最佳诱导时间分别为26h与28h，在最佳诱导时间对突变菌株与转化菌株sGFP分泌水平分析发现，突变菌株sGFP胞外蛋白浓度约占总sGFP浓度的87%，高于转化菌株的74%。
　　总之，本研究获得以下结论。第一、通过sGFP-Kan表达盒对大肠杆菌lpp基因的定点敲入及后者的敲除，成功实现了sGFP在大肠杆菌基因组中的稳定表达，为大肠杆菌基因组敲入提供了可视化的报告基因标签；第二、与转化表达相比，在染色体lpp位点上原位表达的sGFP提高了其分泌到胞外的可溶性表达水平；第三、与此同时，初步表明大肠杆菌细胞外膜LPP蛋白可能参与sGFP分泌到胞外的过程。为进一步探讨EGPSS系统的分泌机制及提高与sGFP融合蛋白的分泌水平提供了技术支持。