[背景]糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者临床常见的一种微血管并发症。DN早期的主要病理特点是肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚、以肾小球系膜区为主的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)积聚。DN严重影响了患者的生活质量,是糖尿病患者死亡的主要原因之一。在西方国家,DN也是导致终末期肾病的主要原因。目前,在世界范围内,随着糖尿病的患病率增高,DN的患病率也日益增高,DN严重影响了患者的正常生活,并且给人们带来很大的经济压力,已经成为一项严重威胁人类健康的世界性问题。系膜区主要由系膜细胞和其产生的ECM构成的。越来越多的证据表明系膜细胞在DN的发病过程中发挥重要作用。系膜细胞是肾小球的固有细胞,系膜细胞的生理作用多样,具体包括如下几个方面：1、对肾小球毛细血管袢有支持和保护作用；2、可产生多种ECM,主要包含IV型胶原、V型胶原、纤连蛋白等,并在病变情况下致肾小球硬化；3、系膜细胞可产生多种细胞因子,通过自分泌及旁分泌途径参与肾小球炎症反应；4、系膜细胞通过收缩和舒张控制肾小球毛细血管的血流量,进而调节肾小球的滤过功能以及系膜通道的功能；5、系膜细胞可通过吞噬作用转运血浆大分子物质；6、系膜细胞可参与免疫反应；7、某些系膜细胞还具有内分泌功能,可以分泌肾素。在正常生理条件下,体内成熟的系膜细胞以静止表型的形式存在,其增殖与凋亡及ECM的分泌与降解保持在一种动态平衡,其合成基质的能力也较小。但高血糖、血流动力学改变、代谢失调等均可使系膜细胞活化,系膜数量增加凋亡减少以及基质金属蛋白酶的减少,以及由此引起的FN、Col IV等的增多,最终导致过多的ECM的积聚。一些临床研究如“糖尿病控制与并发症试验”(diabetes control and complications trial,DCCT)和“糖尿病控制与并发症的流行病学研究”(epidemiology of diabetes interventions and complications,EDIC)以及“英国前瞻性糖尿病研究”(the UK Prospective Diabetes Study,UKPDS)等均表明高血糖和DN的发生有密切的联系,高糖环境能促进DN特征性、渐进性细胞损伤和功能下降,并指出严格的血糖控制可明显减少DN发生率。研究发现,高血糖可通过以下几条途径引起系膜细胞的改变。1、DAG信号通路：高糖条件下,过多的葡萄糖可通过糖酵解途径合成大量的中间产物磷酸二羟丙酮,磷酸二羟丙酮通过一系列化学反应最终生成DAG。DAG可激活PKC,促使系膜细胞肥大、合成过多的ECM。2、长期慢性高血糖可形成AGE,AGE通过自身氧化产生ROS,最终激活TGFp信号通路。3、氨基己糖通路：当细胞内葡萄糖的浓度增高时,通过糖酵解途径合成的6-磷酸果糖大量增加,从而促使更多葡萄糖进入氨基己糖合成通路,导致系膜细胞合成ECM增多。4、多元醇途径：大量的葡萄糖进入醛糖还原酶途径,导致山梨醇的增多和抗氧化剂大量消耗,ROS含量增加,进一步激活PKC、丝裂原活化蛋白激酶途径和JAK-STAT途径,从而诱发系膜细胞发生一系列的改变。氧在机体组织的正常代谢反应中,可以形成一些自由基。自由基的种类很多,与氧化应激密切相关的主要为ROS,包括超氧阴离子(02-)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H202)等。正常情况下,自由基的产生和清除保持动态平衡。但在高糖、高脂、炎症等病理情况下,体内ROS产生明显增加,机体抗氧化防御能力下降,过多的ROS直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性、DNA损伤,最后导致组织和细胞的损伤。ROS本身还是一种重要的细胞内信使,介导和活化多种信号转导途径,造成组织和细胞的损伤。高糖条件下系膜细胞氧化应激主要来源于线粒体呼吸链、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶等。高糖还可诱导系膜细胞生成过多的氧自由基,这些氧自由基通过激活多元醇途径、AGEs途径、PKC途径,形成正反馈,进一步促进自由基的产生。PKC是一组密切相关的有多种亚型的丝氨酸／苏氨酸激酶家族的成员之一,广泛存在于各组织细胞内,它处于细胞内多条信号传导通路的中心,参与体内很多生理、病理过程。正常生理情况下,PKC存在于细胞质内,并处于失活状态,受到外界刺激时其特异性底物蛋白吸引PKC由胞质转移到细胞膜上,PKC的构象发生改变,PKC处于激活状态。PKC的膜转移现象为PKC激活的重要标志。研究指出,糖代谢异常可通过一系列途径促进DAG合成,促进PKC活化。至此,DAG-PKC通路激活与DN的关系引起众多关注。研究证实,总的PKC抑制剂如staurosporine或者calphostin C均可抑制高糖条件下FN的积聚和ColIV的表达,而PKC激动剂则可促进FN的积聚和ColIV的表达。以上这些结果表明高糖可能通过PKC的活化来调节ECM的合成。高糖通过PKC活化来促进TGF-β1和ECM的表达,其机制可能是TGF-β基因启动子含有活化素结合蛋白-1的结合位点,而活化的PKC可调节原癌基因c-fos和c-jun表达,c-fos和c-jun结合成异二聚体AP-1样转录因子,AP-1可与TGF-β基因启动子相应位点结合,从而调节TGF-β的表达。还有研究证实高糖条件下肾小球系膜细胞经由NADPH氧化酶生成ROS,这一过程依赖于PKC的活化,PKC的活化可明显促进糖尿病体内ROS的生成。转化生长因子(transforming growth factorp,TGFP)作为一种细胞间信号调节蛋白,可调节多种靶基因的表达,在细胞增殖、发育、分化、免疫调节及ECM合成中发挥重要作用。研究表明TGF-β可诱导ECM的成分如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原,FN的表达增加；过量表达的TGF-β可将细胞阻滞于从G1期,抑制细胞增殖导致细胞肥大；很多研究表明DN中TGF-β系统促使肾脏肥大、肾小球硬化及肾小管间质性纤维化；TGF-β可通过减少MMPs的表达,促进PAI-1和基质金属蛋白酶抑制剂的合成来减少ECM的降解。系膜细胞转染反义TGF-β1基因后,也能减少PAI-1mRNA的表达,可见系膜细胞主要通过增加PAI-1水平来抑制ECM降解；TGF-β1还具有强烈促纤维化作用,其过度生成或活性升高是肾脏纤维化过程中的主要的调节因子；高血糖可通过激活PKC、AGEs促进TGF-β表达。TGF-β还能激活MAPK等信号传导通路,而P38MAPK的激活又能进一步促进TGF-β表达,从而形成正反馈通路导致TGF-β的持续激活。最新研究表明,Smads蛋白是TGF-β1与其细胞表面丝/苏氨酸激酶受体结合后,将外界的信号从细胞膜传递到细胞核的过程中极其重要的细胞内信号介导分子。Li J等人研究发现在培养的人肾小球系膜细胞中,高糖可通过诱导Smad2、Smad4的表达,抑制Smad7的表达,诱导ECM合成增多。胰高糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide1,GLP-1)是肠促胰素的一种,由远端回肠和结肠的L细胞分泌。其主要生理作用包括：促进胰岛素的合成和分泌、抑制β细胞凋亡、促进β细胞增殖和新生、抑制胰高糖素分泌、减少食物摄取、延缓胃排空、增强外周组织的葡萄糖利用和减少肝糖输出。GLP-1通过葡萄糖依赖性的促胰岛素的合成和分泌及抑制胰高糖素分泌双向调节血糖。在健康个体中,空腹血糖主要由胰岛素/胰高糖素的基础分泌调节,但餐后血糖主要受胰岛素/肠促胰素影响。艾塞那肽(exenatide)属于GLP-1类似物,是目前国内最早批准上市的GLP-1受体激动剂之一,其主要成分为exendin-4。Exendin-4是一种从北美希拉巨蜥唾液中发现的长效GLP-1受体激动剂,其特殊的结构使exendin-4能更有效地抵抗体内DPP-4的降解,半衰期延长。Exendin-4近年越来越广泛的应用于2型糖尿病的治疗。Exendin-4和GLP-1具有相似的生理功能,可通过葡萄糖依赖的方式促进胰岛素分泌,调节空腹及餐后血糖,保护胰岛β细胞。近期研究发现,GLP-1经由PKA降低了NADPH氧化酶的含量,进一步降低了1型糖尿病大鼠模型的氧化应激和尿白蛋白。还有研究指出exendin-4可减低1型糖尿病大鼠的炎症反应,并且通过这一机制发挥肾脏保护作用。长期应用exendin-4可显著改善2糖尿病小鼠的尿白蛋白排泄率、减轻肾小球肥大和系膜区ECM积聚,同时还能改善小鼠的糖代谢、脂代谢等。以上研究表明GLP-1或者exendin-4可能对肾脏具有一定的保护作用。前述提示,DN的病因和发病机制复杂,其中系膜细胞在肾小球硬化和纤维化中起关键作用。在高糖条件下,系膜细胞产生一系列的变化,如氧化应激增强、PKC激活等,这些信号分子均可导致TGF-smad信号通路活化,最终引起系膜区ECM积聚,肾小球硬化和纤维化。现有的研究提示exendin-4可能对DN的肾脏具有保护作用,但是exendin-4发挥肾脏保护作用的机制尚不清楚,目前关于这方面的研究较少。本课题以大鼠系膜细胞为研究对象,观察exendin-4对高糖条件下系膜细胞损伤的保护作用并探讨其可能的保护机制,希望为exendin-4在治疗2型糖尿病的同时,发挥DN保护作用提供更多的理论支持,为2型糖尿病的治疗方案提供一些参考。具体研究内容分为以下四部分：第一部分Exendin-4对高糖条件-下大鼠系膜细胞增殖、细胞周期和ECM分泌的影响[目的]观察Exendin-4对高糖条件下大鼠系膜细胞增殖、细胞周期和ECM分泌的影响。[方法]1、以大鼠系膜细胞为实验对象。采用含10%胎牛血清的DMEM(低糖)完全培养基培养,置于37℃、5%C02的培养箱内。2、实验分组：各干预组分组(6组)：(1)control组：采用含糖5.6mmol/L的DMEM培养基培养(2)HG组：采用含糖30mmol/L的DMEM培养基培养(3)HG+E1组：采用exendin-4(lnmol/L)预处理24h,弃去培养基,然后加入含糖30mmol/LDMEM培养基和exendin-4(1nmol/L)共孵育。(4)HG+E5组：采用exendin-4(5nmol/L)预处理24h,弃去培养基,然后加入高糖培养基和exendin-4(5nmol/L)共孵育。(5)HG+E10组：高糖(30mmol/L)+exendin-4(10nmol/L):采用exendin-4(10nmol/L)预处理24h,弃去培养基,然后加入高糖培养基和exendin-4(10nmol/L)共孵育。(6)HG+E15组：采用exendin-4(15nmol/L)预处理24h,弃去培养基,然后加入高糖培养基和exendin-4(15nmol/L)共孵育。以上各组正式干预前均采用含0.5%FBS的DMEM培养基培养24h,以保持各组细胞同步化生长。3、分别在干预结束后,采用MTT法检测增殖；流式细胞术检测细胞周期；Elisa法检测细胞上清中Col Ⅳ和FN含量。4、实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,两样本均数比较采用独立样本t检验；各组之间采用单因素方差分析(One-way ANOVA);方差齐时,多重比较采用LSD法。方差不齐时采用Welch法校正,当P<0.05时用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞细胞增殖的影响分别培养24h和48h后,与control组比较,HG组均可显著促进系膜细胞增殖。培养24h,与control组比较,HG组均可显著促进系膜细胞增殖,Exendin-4(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)均可显著抑制高糖诱导的系膜细胞增殖,差异具有统计学意义。继续培养至48h,不同浓度的Exendin-4均可显著抑制高糖诱导的系膜细胞增殖,差异具有统计学意义。2.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞细胞周期的影响培养48h时结果显示与control组相比,HG组能显著促进细胞由G1期进入S期,Go/G1期细胞比例显著降低,S期、G2细胞比例显著增高,差异具有统计学意义。与HG组相比,Exendin-4(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)可显著增加G0/G1期细胞比例,并且随着exendin-4浓度的增高,G0/G1期细胞比例逐渐增加,差异具有统计学意义；Exendin-4(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)可显著降低S期细胞比例,exendin-4(10nmol/L、15nmol/L)可显著降低G2细胞比例,并且随着exendin-4浓度的增高,S期、G2细胞比例逐渐降低,差异具有统计学意义。3.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞FN的影响与control组比较,培养24h和48h后HG组系膜细胞上清液中FN的合成显著增加；培养24h后,Exendin-4(10nmol/L、15nmol/L)可显著降低系膜细胞上清液中FN的合成,差异具有统计学意义(P<0.05)；培养48h后与HG组相比,Exendin-4(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)可显著降低系’膜细胞上清液中FN的表达,差异具有统计学意义。4.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞ColⅣ的影响与control组比较,HG组在24h和48h系膜细胞上清液中ColⅣ的合成显著增加；培养24h后,exendin-4(10nmol/L、15nmol/L)可显著降低细胞培养上清液中ColⅣ的合成；培养48h后,exendin-4(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)对高糖刺激的系膜细胞上清液中ColⅣ的合成都有显著的抑制作用,差异具有统计学意义。[结论]Exendin-4可显著抑制高糖条件下系膜细胞的增殖,并将细胞阻滞于细胞G1期；并且Exendin-4能够显著降低高糖条件下FN、ColⅣ的合成。提示Exendin-4可能对肾脏具有一定的保护作用。第二部分Exendin-4对高糖条件下大鼠系膜细胞TGF-β1-Smad信号通路的影响[目的]初步探讨Exendin-4对高糖条件下大鼠系膜细胞培养上清TGF-β1和细胞内Smad2、Smad3和Smad7表达的影响。[方法]1、以大鼠系膜细胞为实验对象。采用含10%FBS的DMEM(含糖5.6mmol/L)完全培养基培养,置于37℃、5%CO2的培养箱内。2、实验分组：各干预组分组(3组)：(1)control组：采用含糖5.6mmol/L的DMEM培养基培养(2)HG组：采用含糖30mmol/L的DMEM培养基培养(3)HG+E10组：高糖(30mmol/L)+exendin-4(10nmol/L):采用exendin-4(10nmol/L)预处理24h,弃去培养基,然后加入高糖培养基和exendin-4(10nmol/L)共孵育。以上各组正式干预前均采用含0.5%FBS的DMEM(含糖5.6mmol/L)培养基培养24h,以保持各组细胞同步化生长。3、分别在干预结束后,采用实时荧光定量技术检测系膜细胞TGF-β1、Smad2、 Smad3、Smad7mRNA的表达；采用Elisa法检测系膜细胞培养上清TGF-β1的表达；采用Western blotting方法检测Smad2、Smad3、Smad7蛋白的表达。4、实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA);方差齐时,多重比较采用LSD法。方差不齐时采用Welch法校正,当P<0.05时用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞TGF-β1mRNA表达的影响培养24h,与control组相比,HG组的TGF-β1mRNA表达显著增加差异具有统计学意义；与HG组相比,HG+E10组TGF-β1mRNA表达有所降低,但无统计学意义。2.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞Smad2mRNA表达的影响培养24h,与control组相比,HG组的Smad2mRNA表达有增加趋势,但无统计学意义；与HG组相比,HG+E10组Smad2mRNA表达有所降低,但无统计学意义。3.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞Smad3mRNA表达的影响培养24h,与control组相比,HG组的Smad3mRNA表达有增加趋势,但无统计学意义；与HG组相比,HG+E10组Smad3mRNA表达有所降低,但无统计学意义。4.对高糖条件下系膜细胞Smad7mRNA表达的影响培养24h,与control组相比,HG组的Smad7mRNA表达明显降低,具有统计学意义；与HG组相比,HG+E10组Smad7mRNA表达显著增加,具有统计学意义。5.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞培养上清TGF-β1表达的影响培养48h,与control组相比HG组细胞培养上清TGF-β1表达显著增加,差异具有统计学意义；与HG组相比,HG+E10组细胞培养上清TGF-β1显著降低,差异具有统计学意义。6.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞Smad2、Smad3蛋白表达的影响培养48h后与control组相比,HG组细胞Smad2、Smad3水平显著增高,差异具有统计学意义；与HG组比,HG+E10组细胞Smad2、Smad3表达水平显著降低,差异具有统计学意义。7.Exendin-4对高糖条件下系膜细胞Smad7蛋白表达的影响培养48h后与control组相比,HG组细胞Smad7水平显著降低,差异具有统计学意义；与HG组比,HG+E10组细胞Smad7表达水平显著升高,差异具有统计学意义。[结论]Exendin-4能够显著抑制高糖条件下系膜细胞Smad2、Smad3的表达,同时促进Smad7的表达,并且exendin-4能够显著抑制高糖条件下系膜细胞TGF-β1的表达,提示Exendin-4可能通过对TGF-β1-Smad信号通路的调节减轻系膜细胞ECM的分泌,发挥肾脏保护作用。第三部分Exendin-4对高糖条件下大鼠系膜细胞氧化应激的影响[目的]初步探讨Exendin-4对高糖条件下大鼠系膜细胞氧化应激的影响。[方法]1、以大鼠系膜细胞为实验对象。采用含10%胎牛血清的DMEM(低糖)完全培养基培养,置于37℃、5%CO2的培养箱内。2、实验分组：(1)control组：采用含糖5.6mmol/L的DMEM培养基培养(2)HG组：采用含糖30mmol/L的DMEM培养基培养(3)HG+E10组：高糖(30mmol/L)+exendin-4(10nmol/L):采用exendin-4(10nmol/L)预处理24h,弃去培养基,然后加入高糖(30mmol/L)培养基和exendin-4(10nmol/L)共孵育。以上各组正式干预前均采用含0.5%FBS的DMEM(含糖5.6mmol/L)培养基培养24h,以保持各组细胞同步化生长。3、分别在干预结束后,采用分光光度法检测系膜细胞培养上清SOD的活性；采用Elisa法检测系膜细胞培养上清GSH、MDA的表达；采用流式细胞术检测细胞内ROS的含量。4、实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA);方差齐时,多重比较采用LSD法。方差不齐时采用Welch法校正,当P<0.05时用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1.Exendin-4对系膜细胞培养上清SOD活性、MDA、GSH含量的影响孵育48h后,与control组相比,HG组细胞培养上清SOD活性、GSH水平显著降低,MDA水平显著升高,差异具有统计学意义；与HG组比,HG+E10组细胞培养上清SOD活性、GSH水平显著升高,MDA水平显著降低,差异具有统计学意义。2.Exendin-4对系膜细胞ROS含量的影响孵育48h后,与control组相比,HG组细胞内ROS水平显著上升,差异具有统计学意义；与HG组比,HG+E10组细胞内ROS水平显著降低,差异具有统计学意义。[结论]Exendin-4能够显著增加高糖条件下系膜细胞培养上清SOD活性、GSH含量,同时还可降低细胞内ROS和细胞培养上清MDA含量,这一研究结果提示Exendin-4可能通过对抑制系膜细胞的氧化应激发挥肾脏保护作用。第四部分Exendin-4对高糖条件下大鼠系膜细胞PKCβⅡ活性的影响[目的]初步探讨Exendin-4对高糖条件下大鼠肾小球系膜细PKCβⅡ活性的影响。[方法]1、以大鼠系膜细胞为实验对象。采用含10%胎牛血清的DMEM(低糖)完全培养基培养,置于37℃、5%CO2的培养箱内。2、实验分组：(1)control组：采用含糖5.6mmol/L的DMEM培养基培养(2)HG组：采用含糖30mmol/L的DMEM培养基培养(3)HG+E10组：高糖(30mmol/L)+exendin-4(10nmol/L):采用exendin-4(1Onmol/L)预处理24h,弃去培养基,然后加入高糖(30mmol/L)培养基和exendin-4(10nmol/L)共孵育。以上各组正式干预前均采用含0.5%FBS的DMEM(含糖5.6mmol/L)培养基培养24h,以保持各组细胞同步化生长。3、分别在干预结束后,采用Western blotting方法检测PKCβⅡ在肾小球系膜细胞膜和细胞浆的表达情况。4、实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA);方差齐时,多重比较采用LSD法。方差不齐时采用Welch法校正,当P<0.05时用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]培养48h后与control组相比,HG组PKCβⅡ活化程度显著增高,差异具有统计学意义；与HG组比,HG+E10组细胞PKCβⅡ活化程度显著降低,差异具有统计学意义。[结论]Exendin-4能够显著降低高糖条件下系膜细胞PKCβⅡ的活化,提示Exendin-4可能通过PKCpII抑制了高糖条件下系膜细胞ROS的生成,进而减少了系膜细胞ECM分泌,并发挥肾脏保护作用的过程。