论文部分内容阅读
目的:基于网络药理学的方法寻找益母草治疗颅脑损伤的活性成分,进而探讨其活性成分-葫芦巴碱治疗颅脑损伤的作用靶点和信号通路,并通过颅脑损伤小鼠模型验证葫芦巴碱的药效及其治疗颅脑损伤的作用机制。方法:1.益母草的网络药理学:应用网络药理学方法,查询中药系统药理学数据库（TCMSP）和中药分子机制的生物信息学数据库（BATMAN-TCM）获取益母草的活性成分;从TCMSP和Swiss Target Prediction（STP）数据库中收集和预测候选化合物的作用靶点。利用疾病靶点标准化数据库（Uniprot）获取益母草活性成分对应的靶标基因,并通过与Genecards、DisGenet、OMIM三个数据库获取的神经损伤的疾病基因做映射,获得益母草治疗神经损伤的潜在作用靶点。通过蛋白互作平台数据库（STRING）构建作用靶点之间的互作关系,并导入Cytoscape3.6.0软件构建靶蛋白互作关系网络（PPI）。最后,对益母草治疗神经损伤的作用靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。2.葫芦巴碱的网络药理学:应用网络药理学方法,从TCMSP、BATMAN-TCM和STP数据库中收集和预测葫芦巴碱的作用靶点,并通过与数据库Genecards获取的颅脑损伤的疾病基因做映射,获得葫芦巴碱治疗颅脑损伤的潜在作用靶点。利用Cytoscape 3.6.0构建葫芦巴碱-作用靶点网络。通过STRING构建作用靶点之间的互作关系,并导入Cytoscape3.6.0软件构建PPI。最后,对葫芦巴碱治疗颅脑损伤的作用靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。3.葫芦巴碱对小鼠颅脑损伤的影响:（1）小鼠模型的制备:采用落重法来制备小鼠颅脑损伤的模型（砝码重量:20g;高度:50 cm）。（2）实验动物分组以及给药:把小鼠分为假手术组（Sham）、颅脑损伤模型组（TBI）、阳性对照（依达拉奉）组（EDA 2 mg/kg）、葫芦巴碱低剂量组（TG 35 mg/kg）、葫芦巴碱高剂量组（TG 140 mg/kg）。小鼠颅脑打击后30 min第一次给药,每24 h给药一次,连续3天腹腔注射给药。（3）检测指标:造模后,取脑组织,利用干湿重法来进行脑含水量变化的检测;利用HE染色来进行脑组织病理改变的观察;利用镀银染色来观察神经病理;LFB染色来观察胼胝体髓鞘完整性;用TUNEL染色来进行脑组织细胞凋亡情况的检测;NeuN染色观察神经元细胞的变化;FJB染色观察神经元变性坏死情况;利用试剂盒检测脑组织中SOD、MDA及GSH-Px水平;第3天取小鼠血检测血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平;利用免疫荧光染色检测脑组织中AQP4、MMP-9表达情况;利用Western Blot检测脑组织中组织凋亡相关蛋白（BCL-2、BAX、Cleaved Caspase3）、MAPK 信号通路相关蛋白（p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK）、AQP4和MMP-9蛋白的表达。结果:1.从益母草中筛选出19个有效活性成分,涉及654个作用靶点,其中与神经损伤有关的作用靶点426个,关键靶点6个。这些靶点基因主要涉及MAPK、Toll样受体、PI3K-Akt、TNF、IL-17和细胞凋亡等信号通路。2.筛选出与葫芦巴碱作用相关的靶点136个,其中与颅脑损伤有关的作用靶点29个,关键靶点6个,这些靶点基因涉及MAPK信号通路、神经营养因子信号通路、细胞因子与细胞因子相互作用、细胞凋亡等相关通路。3.TBI组小鼠脑含水量显著高于Sham组,葫芦巴碱组脑含水量均显著低于TBI组;HE染色结果显示,TBI组小鼠脑组织病理的损伤明显,发生水肿与细胞固缩,而葫芦巴碱组的小鼠脑组织病理损伤则得到了改善,水肿程度的降低、细胞结构也比较完整;镀银染色结果显示,葫芦巴碱可以减少小鼠内囊内存在黑褐色点状聚集,改善颅脑损伤后神经病理情况;LFB染色结果提示,葫芦巴碱可以改善颅脑损伤小鼠胼胝体髓鞘的损伤,保护其完整性;TUNEL染色结果显示,TBI组小鼠的脑细胞凋亡,葫芦巴碱可以降低颅脑损伤所致的细胞凋亡;NeuN染色结果显示,葫芦巴碱能有效改善小鼠颅脑损伤后神经元细胞的损伤;FJB染色结果显示,葫芦巴碱能改善小鼠颅脑损伤后神经元的变性坏死;另外,TBI组较Sham组SOD活性以及GPx的含量均有所下降,同时MDA的含量有所提高（P＜0.05）;葫芦巴碱有效降低炎症因子（IL-1β、IL-6及TNF-α）的水平;葫芦巴碱可以抑制脑组织MMP-9、AQP4的表达;使BCL-2的表达明显升高、BAX与Cleaved Caspase 3的表达明显降低,降低细胞凋亡水平;MAPK信号通路中ERK、p38、JNK磷酸化水平均升高。结论:益母草对颅脑损伤起保护作用的活性成分-葫芦巴碱能发挥有效的神经保护作用,减少TBI小鼠脑含水量、炎症水平,改善脑组织病理损伤,降低脑组织氧化水平,抑制细胞凋亡,抑制MAPK信号通路。