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目的干细胞移植治疗心肌梗死（myocardial infarction,MI）作为极具潜力的治疗手段,目前还面临着移植后细胞存活和分化效率低下的问题。针对心梗后缺血缺氧的微环境,提高细胞移植后生存率、促进干细胞分化成熟是目前研究的关注焦点。作为两种最有临床应用价值的干细胞,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）有较强的外分泌功能,在移植后能通过该途径促进组织修复,目前已被广泛应用于临床研究。而诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSs）具有更接近胚胎干细胞的自我更新和多向分化潜能,能够有效诱导分化为心肌细胞,称诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（induced pluripotent stem cells-cardiomyocytes,i PS-CMs）,并可避免伦理问题,在未来有着更广阔的临床应用前景[1]。本研究通过三七皂苷R1（Notoginsenoside R1,NGR1）预处理以提高MSCs、i PS-CMs的存活和外分泌功能,并探讨经NGR1预处理的MSCs和i PS-CMs移植治疗MI的作用及其内在机制,为临床应用干细胞治疗MI等缺血性心脏病提供理论和实验依据。方法体外培养MSCs,经NGR1预处理后,通过H2O2进行氧化应激模型构建,利用CCK8和TUNEL分别检测NGR1对细胞增殖活性和对抗H2O2诱导损伤的的影响,并通过试剂盒检测细胞内ROS含量,Western Blot检测p-Akt、p-CREB、p-Fox O1的水平,ELISA检测细胞培养液中的IGF-1、VEGF、SCF、b FGF含量,q RT-PCR检测细胞培养液外泌体中mi R-21表达水平,并对各组细胞进行转录组测序,在体外探讨NGR1对MSCs的保护作用。体外培养i PSs,并诱导其向心肌细胞分化,利用CCK8检测NGR1对i PSs-CM增殖的的影响,Western Blot检测p-Akt的水平。构建大鼠、裸鼠MI模型,分别移植NGR1预处理的MSCs或i PS-CMs,通过超声心动图检测治疗后各组动物心功能,经Masson三色染色测定心肌梗死面积和梗死区胶原纤维沉积,通过TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光染色检测梗死区HNA、c Tn T、Cx43、v WF、α-SMA、Lyve-1的表达,q RT-PCR检测梗死心肌组织中IGF-1、VEGF、VEGFC、SCF、b FGF的表达,明确NGR1预处理后的MSCs或i PS-CMs移植治疗效果及可能的机制。结果不同浓度NGR1能够促进MSCs增殖。在300μM的H2O2刺激条件下,0.1μM的NGR1处理24h或48h均可显著保存细胞活性,保护细胞免受H2O2造成的损伤,1μM的NGR1和10μM的NGR1处理也可以提高MSCs的细胞活性,但明显低于0.1μM的NGR1。0.1μM的NGR1是保护MSCs的最佳浓度。NGR1处理MSCs后,p-Akt、p-Fox O1的水平明显增加,p-CREB水平无明显变化。加入PI3K抑制剂LY294002后,各组各时间点p-Akt水平相近,p-Fox O1水平相近。DAPI和TUNEL染色显示,300μM的H2O2处理后可以显著地增加凋亡的MSCs数量,并显著提高MSCs中的ROS含量,而NGR1可以明显降低MSCs的凋亡和ROS水平,而加入PI3K抑制剂LY294002后,凋亡MSCs的数量显著增加,ROS含量升高。NGR1可以促进体外培养的MSCs释放IGF-1、VEGF、SCF、b FGF,LY294002可以抑制NGR1对以上细胞因子的促进作用。NGR1处理还能够提高MSCs外泌体中mi R-21的水平。转录组测序结果表明,NGR1的影响会富集到的信号通路包括合成和代谢相关的通路和凋亡信号通路,如:脂肪酸代谢、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、p53信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路等。其他一些通路也明显被激活,如内吞、细胞周期等。MSCs移植可以提高MI大鼠EF和FS值,并降低LVIDs和LVESV值。NGR1预处理的MSCs移植组中EF和FS值最高,LVIDs和LVESV值最低。Masson三色染色检测发现,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可降低梗死面积和胶原沉积。NGR1预处理的MSCs移植组梗死面积和梗死区胶原纤维沉积显著低于PBS组和MSCs移植。PBS组大鼠梗死区室壁厚度明显减少,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均能增加梗死区室壁厚度,并且NGR1预处理的MSCs移植组大鼠中梗死区室壁厚度明显高于MSCs移植组。通过GFP示踪移植细胞的存活发现,NGR1预处理的MSCs移植组中MSCs数量明显高于MSCs移植组。TUNEL染色检测各组梗死区凋亡细胞的数量发现,PBS组中凋亡细胞数量最多,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可减少细胞凋亡。免疫荧光染色检测v WF和α-SMA并统计各组血管密度发现,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可提高梗死区微血管数目和α-SMA阳性血管数目。与MSCs移植组相比,NGR1预处理的MSCs移植组中梗死区微血管数量和α-SMA阳性血管数量明显增多。ELISA检测各组梗死区心肌组织中IGF-1、SDF-1和VEGF的含量发现,与PBS组相比,MSCs移植可提高IGF-1、SDF-1和VEGF的水平,而NGR1预处理的MSCs移植组中各细胞因子的水平明显高于MSCs移植组。通过对GSK3和Wnt信号通路的抑制和控制细胞浓度可以有效诱导hi PSs分化为hi PS-CMs,免疫荧光染色检测到诱导分化后的细胞表达c Tn T。在6孔板中最佳诱导条件为100万细胞/孔,CHIR99021浓度为6μM。经NGR1处理后,各组间OD值无明显差别。但随着药物处理时间的增加,0.1μM、1μM、10μM NGR1均能够表现出促进hi PS-CMs增殖的趋势。药物处理72h后,0.1μM组促进趋势最为明显。NGR1处理hi PS-CMs后,p-Akt水平有明显提升。加入PI3K抑制剂LY294002后,p-Akt的活化受到显著抑制。hi PS-CMs移植后2周时,注射i PS-CMs组（IC）,其心功能指标EF、FS相较于MI组有明显的改善,LVEDV、LVIDd相较于Control组和MI组有所升高,LVESV、LVIDs相较于MI组有所降低。注射经NGR1预处理的i PS-CMs组（NIC）,其心功能指标EF、FS优于IC组,LVEDV、LVIDd、LVESV、LVIDs指标的恢复趋势也优于IC组。4周时,NIC组其心功能指标EF、FS相较于MI组亦有着明显的改善,并优于IC组。Masson三色染色检测发现,IC组和NIC组梗死面积和胶原沉积均降低。MI组裸鼠梗死区室壁厚度明显减少,hi PS-CMs移植和NGR1预处理的i PS-CMs移植均能增加梗死区室壁厚度。NIC组裸鼠中梗死区室壁厚度明显高于IC组。TUNEL染色结果显示,hi PS-CMs移植可以降低凋亡数量,而0.1μM NGR1预处理的hi PS-CMs移植相较于hi PS-CMs移植,可以更明显地地减少心脏组织的细胞凋亡。HNA和c Tn T染色结果显示,NGR1预处理可以促进移植hi PS-CMs的存活数量,并且大部分移植的i PS-CMs均表达c Tn T。v WF和Lyve-1染色结果表明,NGR1预处理还能提高i PS-CMs移植后的血管密度和淋巴管密度。NGR1预处理的hi PS-CMs移植组中各细胞因子VEGFC、IGF-1、SDF-1的水平明显高于hi PS-CMs移植组和MI组。结论NGR1可以保护MSCs对抗H2O2造成的细胞凋亡,促进IGF-1、VEGF、SCF和b FGF的分泌,其机制可能与PI3K/Akt/Fox O1信号通路有关。NGR1预处理可能通过增强MSCs的存活和旁分泌途径提高MSCs移植治疗MI的作用。通过对GSK3和Wnt信号通路的抑制和控制细胞浓度可以有效诱导i PS分化为hi PS-CMs。NGR1有促进hi PS-CMs增殖的趋势并可提高p-Akt的水平。NGR1预处理能够提高hi PS-CMs移植治疗裸鼠MI的作用,其主要机制可能与增强细胞的存活和旁分泌途径有关。