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即便今天在癌症治疗方面取得了巨大的成就,极大改善了癌症患者生存期,但癌症仍然是导致全球死亡的主要因素之一。这种高死亡率原因不只是与肿瘤本身有关,而且还与肿瘤合并血管性疾病、化疗耐药、复发转移及手术放化疗等治疗的并发症高度相关。其中合并血管性疾病中危害最大的是心血管疾病和中风,而其中一部分血管疾病发生在血管生成抑制剂治疗后。这些药物越来越多的被报道能导致血管内皮功能障碍,从而继发血管性疾病。伐珠单抗是在临床上适用范围较广、效果较好的阻断肿瘤血管生成的单克隆抗体,在结直肠癌、非小细胞肺癌治疗中效果显著,它主要针血管内皮生长因子A（VEGF-A）发挥作用。但在临床应用过程中,发现了诸多不良反应,其中包括动静脉血栓、出血、胃肠道穿孔,以及常见事件高血压和蛋白尿等。其中,动、静脉血栓是最严重的不良事件。动脉血栓栓塞事件包括缺血性脑血管疾病和心肌梗塞。研究发现贝伐珠单抗（Bevacizumab,Bev）相关血管并发症主要是与贝伐珠单抗导致血管内皮功能障碍和损伤有关,同时有相关炎症因子参与。对于贝伐珠单抗造成血管损伤,能否引入一种药物来减轻这种损害?查阅大量文献后发现二甲双胍在内皮保护方面证据更多,更为首选。既往研究证实二甲双胍在抗内皮细胞氧化应激、抗炎、抑制内皮细胞的通透性、抑制内皮细胞凋、促进内皮祖细胞（EPCs）分化、减轻动静脉血栓等方面发挥着重要作用。但这些都是二甲双胍在肿瘤或其它疾病中发挥的作用,目前还没有在应用贝伐珠单抗的肿瘤患者中发挥积极作用的相关证据。因此本研究从临床、小鼠和细胞三个层面探讨贝伐珠单抗对内皮细胞的影响,论证二甲双胍是否能改善这种影响和相应机制。本研究分三部分在贝伐珠单抗诱导的内皮损伤及二甲双胍缓解贝伐珠单抗诱导的内皮损伤机制方面进行了研究:第一部分:在接受化疗联合贝伐珠单抗治疗的Ⅳ期非小细胞肺癌、Ⅳ期结直肠癌患者中,探索化疗联合贝伐珠单抗对内皮细胞损伤标志物和促炎因子的影响。第二部分:探讨贝伐珠单抗对C57雄性小鼠血管内皮损伤、炎症及内皮组织切片镜下结构的影响;进一步探讨探讨二甲双胍能否减轻这些影响及其机制。第三部分:探讨贝伐珠单抗对人脐静脉内皮细胞损伤、凋亡、炎症的影响;进一步探讨二甲双胍能否减轻上述影响及其机制。第一部分贝伐珠单抗在非小细胞肺癌、结直肠癌患者中对内皮细胞损伤标志物和促炎因子的影响目的:回顾我院肿瘤免疫治疗科2021年6月至2022年12月收治的接受了化疗或化疗联合贝伐珠单抗治疗Ⅳ期非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）、Ⅳ期结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）45例患者资料,对化疗联合贝伐珠单抗对内皮细胞损伤标志物和促炎因子的影响进行分析。方法:根据应用贝伐珠单抗与否,分为对照组（Control）和贝伐珠单抗组（Bev）。在CRC患者中采用m-FOLFOX6化疗方案,NSCLC患者中采用联合含铂化疗方案。贝伐珠单抗以静脉输注7.5mg/kg,每隔3周给药1次。收集患者的年龄、性别、疾病类型、血小板、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、用药前及用药后血管性血友病因子（von Willebrand Factor,v WF）、E选择素（E-selectin,CD62E）、内皮素（Endothelin,ET-1）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、凝血酶调节蛋白（Thrombomodulin,TM）等指标。结果:1.两组患者的临床资料比较Control组20例:直肠癌6例,结肠癌3例,肺腺癌11例。Bev组25例:直肠癌7例,结肠癌6例,肺腺癌12例。在Bev组出现高血压1例,蛋白尿2例,静脉血栓1例、鼻出血1例。各组一般资料经分析差异无统计学意义（P＞0.05）。2.贝伐珠单抗对直结肠癌或肺腺癌患者内皮损伤标志物的影响分别对两组间治疗前、治疗后血液中的CD62E、ET-1、TM、v WF进行比较,治疗前两组间CD62E、ET-1、TM、v WF无显著差异（P＞0.05）;但在治疗后血液中上述指标Bev组较Control组显著升高（P＜0.001）。分别在Bev组和Control组中对治疗前与治疗后血液中的CD62E、ET-1、TM、v WF进行比较,Control组上述指标用药前、后无统计学差异（P＞0.05）,Bev组可见用药后较用药前显著升高（P＜0.001）。3.贝伐珠单抗对结直肠癌或肺腺癌者促炎因子的影响分别对两组间治疗前、治疗后血液中的IL-6、TNF-α进行比较,两组间治疗前IL-6、TNF-α无显著差异（P＞0.05）,但在治疗后上述指标Bev组较Control组显著升高（P＜0.001）。分别在Bev组和Control组中对治疗前与治疗后血液中的IL-6、TNF-α进行比较,Control组及Bev组上述指标在治疗后较治疗前均升高（P＜0.01）,但Bev组中升高更显著（P＜0.001）。结论:1.贝伐珠单抗可能导致转移性结直肠癌或肺腺癌者内皮细胞损伤。2.贝伐珠单抗可能导致转移性结直肠癌或肺腺癌者血清中促炎症因子升高。第二部分二甲双胍通过上调GDF15和激活PI3K/AKT/FOXO/PPARγ信号通路缓解贝伐珠单抗诱导的小鼠血管内皮细胞损伤目的:通过在C57雄性小鼠中应用贝伐珠单抗,探讨贝伐珠单抗对血管内皮损伤、炎症及内皮组织切片镜下结构的影响;进一步探讨二甲双胍（Metformin,MET）能否减轻贝伐珠单抗诱导血管内皮的上述影响及其机制。方法:分组:24只C57雄性小鼠随机分为两部分共八组:1)Control 2)Bev 3)Met 4)Bev+Met 5)AAV-GP-1-NC+Bev 6)AAV-GP-1-NC+Bev+Met 7)AAV-GP-1-si GDF15+Bev 8)AAV-GP-1-si GDF15+Bev+Met。喂养:给予Met 1200mg/kg每天灌胃,持续7周;Bev 15mg/kg腹腔注射,1次/3天;AAV-GP-1-si GDF15或AAV-GP-1-NC尾静脉注射（0.2ml/只）,2周后重复注射一次。取材及检测:取眼眶血用于ELISA试剂盒检测相关指标;取腹主动脉,分三份:分别用于HE染色后观察镜下组织切片;PCR和Wesrern检测。结果:1.Bev对小鼠腹主动脉内皮细胞凋亡、损伤标志物和炎症因子的影响对小鼠腹主动脉血管内皮经HE后染色显微镜下可见Bev增加了小鼠腹主动脉血管内皮细胞的凋亡。Bev增加了小鼠静脉血中CD62E、ET-1、TM和v WF水平（均P＜0.001）,增加了IL-6（P＜0.05）、TNF-α（P＜0.001）的表达。2.Met减轻了贝伐珠单抗诱导的小鼠腹主动脉血管内皮的影响Met治疗降低了Bev诱导的小鼠腹主动脉血管内皮细胞的凋亡,降低了Bev处理小鼠静脉血中CD62E（P＜0.001）、v WF和ET-1（P＜0.01）、TM、IL-6、TNF-α的表达水平（P＜0.05）。同时,Met增强了Bev小鼠中GDF15和PI3K、PPARγ（P＜0.001）、Bcl-2（P＜0.05）的mRNA和蛋白的表达,增加了p-AKT、p-FOXO3a蛋白表达,降低了Bax mRNA（P＜0.01）和蛋白的表达。对应用Bev处理的si-NC小鼠腹主动脉的HE染色显示:与Bev组相比,Met与Bev联合减少了小鼠腹主动脉内皮细胞的凋亡;在血管内皮损伤标志物和炎症因子方面,Met与Bev联合降低了小鼠静脉血中的CD62E、TM（P＜0.01）、ET-1、v WF、IL-6和TNF-α（P＜0.05）的水平,同时增加了GDF15、PI3K、PPARγ（P＜0.001）和Bcl-2（P＜0.01）的mRNA和蛋白质的表达,促进了AKT和FOXO3蛋白的磷酸化,降低了Bax mRNA（P＜0.05）和蛋白质表达。3.GDF15的低表达可抑制PI3K/AKT/FOXO/PPARγ信号通路表达腹主动脉的HE染色显示:Bev处置si-GDF15小鼠和si-NC小鼠的腹主动脉内皮细胞都表现出凋亡,但si-GDF15凋亡更显著。在应用Bev的基础上,与si-NC小鼠相比,si GDF15小鼠血清中TM（P＜0.01）、v WF（P＜0.001）、ET-1、IL-6和TNF-α（P＜0.05）的表达水平增加;此外,GDF15、PI3K、PPARγ、Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显着降低,但Bax mRNA和蛋白质表达水平显着增加（P＜0.001）。4.二甲双胍通过上调GDF15和激活PI3K/AKT/FOXO/PPARγ信号通路缓解贝伐珠单抗诱导的小鼠腹主动脉内皮损伤在同时应用Met和Bev的基础上,与si-NC小鼠相比,si-GDF15小鼠中腹主动脉内皮细胞损伤和凋亡显著增加,CD62E、ET-1、TNF-α（P＜0.05）、TM、v WF（P＜0.01）和IL-6（P＜0.01）的表达也增加。在si-GDF15小鼠中GDF15、PI3K、PPARγ、Bcl-2的mRNA蛋白表达水平显着减少,Bax mRNA和蛋白质表达水平显着增加（P＜0.001）。结论:1.贝伐珠单抗导致小鼠腹主动脉血管内皮细胞的炎症、损伤和凋亡。2.二甲双胍降低了贝伐珠单抗诱导的小鼠腹主动脉内皮细胞炎症、损伤和凋亡。3.二甲双胍可能通过GDF15激活PI3K/AKT/FOXO/PPARγ信号通路减轻贝伐珠单抗诱导的小鼠腹主动脉内皮细胞的影响。第三部分二甲双胍通过上调GDF15和激活PI3K/AKT/FOXO/PPARγ信号通路缓解贝伐珠单抗诱导的人脐静脉内皮细胞损伤目的:在人脐静脉内皮细胞中探讨贝伐珠单抗对血管内皮细胞炎症、损伤、凋亡的影响;进一步探讨二甲双胍能否减轻贝伐珠单抗诱导血管内皮上述影响及其机制。方法:主要应用了RNA干扰技术、RT-qPCR、Western-blot、ELISA技术和Annexin V-FITC检测细胞凋亡等方法,观察在不同分组下人脐静脉内皮细胞系中用CD62E、ET-1、TM、v WF、TNF-α和IL-6的表达和GDF15、PI3K、AKT、FOXO3、PPARγ、BCL-2、BAX的mRNA及蛋白表达情况。结果:1.Met对Bev诱导的HUVECs细胞凋亡、血管内皮损伤标志物和炎症的影响Bev增加了HUVECs的细胞凋亡,而Met治疗降低了Bev治疗的HUVECs的细胞凋亡（P＜0.001）。Bev治疗增加了HUVECs中CD62E、ET-1、TM和v WF水平,Met治疗降低了除CD62E外的这些管内皮损伤标志物水平（均P＜0.05）。Bev也提高了HUVECs中TNF-α和IL-6的表达,但Met降低了Bev诱导的HUVECs中TNF-α和IL-6的表达（所有P＜0.001）。Met增强了Bev处置HUVECs中GDF15的表达和PI3K/AKT/FOXO/PPARγ信号通路的激活。2.GDF15过表达对Bev诱导的HUVECs细胞凋亡、血管内皮损伤标志物和炎症的影响GDF15质粒转染HUVECs细胞后,GDF15mRNA（P＜0.001）和蛋白表达上调。Bev处置后,GDF15过表达降低了HUVECs的细胞凋亡和TNF-α和IL-6的表达（均P＜0.01）,抑制了CD62E、ET-1、TM和v WF（均P＜0.05）的表达,使PI3K、PPARγ、Bcl-2 mRNA表达升高,而Bax mRNA表达降低（均P＜0.01）,PI3K、P-AKT、P-FOXO3、PPARγ和Bcl-2蛋白表达增加,而Bax蛋白表达降低。3.GDF15siRNA对Bev诱导的HUVECs细胞凋亡、血管内皮损伤标志物和炎症的影响。转染siRNA后,GDF15mRNA的相对表达量（所有P＜0.001）和蛋白表达量均下调。GDF15siRNA减弱了Met对Bev诱导的HUVECs细胞的凋亡、TM、v WF、TNF-α和IL-6表达的影响（所有P＜0.01）,但并没有降低CD62E或ET-1在Bev中的表达（所有P＞0.05）;降低了Met对Bev处理的HUVECs中PI3K、PPARγ、Bcl-2和Bax mRNA表达的影响（所有P＜0.001）;同时PI3K、PPARγ、Bax、Bcl-2蛋白的表达表现出与上述相似的趋势,P-AKT和P-FOXO3蛋白的表达也表现出相似的趋势。4.LY 294002对贝伐珠单抗诱导的HUVECs细胞凋亡、血管内皮损伤标志物和炎症的影响。LY 294002减弱了Met对Bev诱导的HUVECs的ET-1、TM、v WF、TNF-α、IL-6表达的影响,但对细胞凋亡或CD62E表达的无显著影响（P＞0.05）;下调了PI3K、PPARγ和Bcl-2的mRNA表达,但上调了Bax mRNA的表达（所有P＜0.01）,但它并没有改变Bev和Met处理的HUVECs中GDF15 mRNA的表达（P＞0.05）。在蛋白表达方面,LY294002降低了PI3K、P-AKT、P-FOXO3、PPARγ、Bcl-2蛋白的表达,但增加了Bax蛋白的表达,而没有改变GDF15蛋白的表达。结论:1.贝伐珠单抗可以导致HUVECs炎症、损伤和凋亡。2.二甲双胍能减轻贝伐珠单抗诱导的HUVECs炎症、损伤和凋亡。3.GDF15过表达能减轻贝伐珠单抗诱导的HUVECs凋亡、血管内皮损伤和炎症。4.二甲双胍可能通过GDF15激活PI3K/AKT/FOXO/PPARγ信号通路来影响贝伐珠单抗在HUVECs中诱导的细胞凋亡、血管内皮损伤标志物和炎症。