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血管性痴呆(Vascular Dementia,VaD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征,是继阿尔茨海默病(AD)之后发病率第二的痴呆。目前,VaD在临床上依然缺乏有效的治疗手段。缺血缺氧应激状况下,钙蛋白酶抑制蛋白表达下调,导致钙蛋白酶激活,从而导致神经元受损。新型钙调蛋白拮抗剂DY-9836可减少钙蛋白酶抑制蛋白的水解,且可改善由缺血所致的血脑屏障损伤,降低脑部梗死部位面积,发挥神经保护作用,但存在水溶性差、半衰期短、血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)渗透性不足等问题。纳米给药系统是提高药物生物利用度和BBB渗透性的有效手段。多聚唾液酸(polysialicacid,PSA)是一种均一多聚的生物可降解的内源性聚合物。作为亲水链段,PSA在体内可阻止免疫系统蛋白及细胞与药物间的相互作用从而对药物起到保护作用,同时由于PSA所占空间体积大并带有负电荷,可通过减少尿排泄和肝脏摄取而延长药物在体内的循环时间。我们前期研究发现基于PSA的嫁接物胶束可分布至脑内,因此,本研究以新型钙调蛋白拮抗剂DY-9836为模型药物,以多聚唾液酸为亲水材料,构建聚合物胶束给药系统,以提高DY-9836 的 BBB 渗透性,实现药物向脑部的有效递送。首先,通过硬脂胺(octadecylamine,ODA)上氨基和PSA上羧基间的酰胺反应,合成多聚唾液酸-硬脂胺嫁接物(PSA-ODA)。当ODA投料比为10%时,合成得到的PSA-ODA嫁接物中ODA的取代度为3.9%,嫁接物临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)为 120.0 μg/ml,嫁接物胶束粒径为 145.7±2.1 nm。PSA-ODA嫁接物胶束可有效负载疏水性药物DY-9836,当DY-9836投药量为4%时,PSA-ODA嫁接物胶束对药物的载药量为3.6%,包封率可达90%,制备得到的PSA-ODA/DY-9836载药胶束粒径为107.0±4.0nm。体外释放结果显示,PSA-ODA/DY-9836胶束中DY-9836药物可持续释放至72 h。以SD大鼠为模型动物,以DY-9760e为内标,采用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)考察PSA-ODA/DY-9836嫁接物载药胶束的体内药代动力学。研究结果显示DY-9836被包载进PSA-ODA嫁接物胶束中后,其半衰期从1.27±0.27h增加至 3.43±0.34 h,血浆清除率从 2.34±0.24 L/h/kg 降低至 1.20±0.14 L/h/kg,平均滞留时间从 1.67±0.17 h 增加到 3.98±0.10h;DY-9836 和 PSA-ODA/DY-9836给药后血药浓度分别在0.33 h和0.5 h达峰值,PSA-ODA/DY-9836载药胶束组最大血药浓度是游离DY-9836组的1.38倍;游离DY-9836组和PSA-ODA/DY-9836嫁接物载药胶束组药时曲线下面积分别为437.27±52.74和836.42±90.69 μg/L/h。以bEnd.3细胞为模型,采用盐酸四唑盐比色法(MTT assay)法考察PSA-ODA嫁接物的细胞毒性。结果显示,当PSA-ODA嫁接物胶束浓度达到1000 μg/mL时,细胞存活率仍高于65%,表明PSA-ODA嫁接物具有低细胞毒性。以bEnd.3细胞为模型,采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪考察PSA-ODA嫁接物胶束的细胞内在化能力及具体机制。结果表明:细胞对PSA-ODA嫁接物的摄取呈时间依赖性,胞内荧光强度随时间延长而增加;细胞和荧光标记嫁接物胶束在4℃孵育后,胞内荧光强度与对照组相比显著下降,表明细胞对PSA-ODA嫁接物胶束的摄取是主动转运过程;细胞经网格蛋白抑制剂氯丙嗪预处理后再与荧光标记嫁接物胶束孵育,胞内荧光强度下降32.1%,表明细胞主要通过网格蛋白途径摄取PSA-ODA嫁接物胶束。采用bEnd.3细胞构建体外BBB模型,考察PSA-ODA/DY-9836载药胶束的BBB渗透能力。结果显示,PSA-ODA/DY-9836载药胶束组的表观渗透系数(Papp)显著高于游离DY-9836组,表明DY-9836被包载进PSA-ODA嫁接物胶束中后其BBB渗透能力显著提高。以成年雄性C57BL/6J小鼠为模型动物,建立右侧颈总动脉结扎模型(rUCCAO),以吲哚菁绿(ICG)为荧光探针,采用小动物活体成像仪考察PSA-ODA嫁接物胶束在小鼠脑组织中的分布。结果显示,PSA-ODA/ICG胶束经腹腔给药2 h和4h后,小鼠脑中的荧光强度均显著高于游离ICG组;冠状脑切片荧光成像照片显示PSA-ODA嫁接物胶束主要分布在海马区。以DY-9760e为内标,采用HPLC-FLD法定量检测海马区和其他脑组织中DY-9836浓度。结果显示,PSA-ODA/DY-9836嫁接物载药胶束和DY-9836经腹腔给药后,海马区和其他脑组织中药物浓度均呈现先上升再下降的趋势,给药1h后脑中药物浓度最高;且海马区中药物浓度均高于其他脑组织;海马区中PSA-ODA/DY-9836组的药物浓度在给药0.5、1、2、4和6 h后均高于DY-9836组,与小动物活体成像仪观察到的结果相一致。综上所述,本研究构建的PSA-ODA嫁接物可有效负载水难溶性药物DY-9836并实现药物的缓释。DY-9836被包载进PSA-ODA胶束中后,其体内半衰期延长,药时曲线下面积显著提高,体内外BBB渗透性均有显著增强,且药物在海马区中的分布高于其他脑组织,因此,本研究构建的PSA-ODA/DY-9836纳米给药系统在VaD治疗中有较好的应用前景。