论文部分内容阅读
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起的一种急性和高度传染性肠道疾病。PEDV感染所有年龄段的猪,引起呕吐和腹泻等症状。PEDV在感染成年猪时仅产生消瘦等轻微症状,而在感染新生仔猪时表现出近100%的死亡率。该病于1971年首次在英国报道以来,到目前为止仍在多个国家和地区流行。并且由于PEDV流行毒株发生变异并且缺乏有效的疫苗,给世界养猪业造成重大的经济损失。本课题PEDV感染对细胞自噬的调控机制及自噬对PEDV的复制的影响进行研究,从而为揭示PEDV的分子致病机制及PED防控提供理论支撑。为了鉴定PEDV感染是否引起内质网应激,本研究使用PEDV（MOI为0.5）感染Vero细胞,并在病毒接种后的0、6、12、18和24h时收集细胞。通过western blot方法检测内质网应激标志蛋白GRP78的表达水平。结果显示PEDV感染引起Vero细胞中的GRP78蛋白表达增加,提示PEDV感染Vero细胞可引起内质网应激。随后,使用western blot方法检测PEDV感染Vero细胞中未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）的3条信号通路PERK/e IF2、IREI/JNK和ATF6的激活情况。结果显示PEDV感染Vero细胞引起PERK和e IF2的磷酸化水平增加,IRE1和JNK的磷酸化水平增加,同时ATF6蛋白发生切割。以上结果提示PEDV感染Vero细胞引起内质网应激并且激活了PERK/e IF2、IREI/JNK和ATF6信号通路。为了鉴定PEDV感染Vero细胞是否引起自噬。分别使用western blot方法检测PEDV感染Vero细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达和p62蛋白的表达水平,结果显示PEDV感染促使LC3II/LC3I蛋白表达比值升高,同时降低p62蛋白的表达。这些结果提示PEDV感染Vero细胞能诱导自噬过程的发生。内质网应激是自噬的引发原因之一。为了鉴定PEDV感染诱导的内质网应激是否调控自噬的发生,在接种PEDV 1 h前使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate,4-PBA）预处理细胞,随后检测细胞的自噬水平。结果显示,与PEDV感染细胞相比,4-PBA处理能降低病毒感染细胞的LC3II/LC3I蛋白表达比值。进一步研究UPR信号通路是否参与PEDV诱导的自噬过程,使用PERK抑制剂GSK2606414,IRE1抑制剂STF-083010和ATF6抑制剂AEBSF,分别作用PEDV接种的Vero细胞,随后检测细胞的自噬水平。结果显示,与PEDV感染细胞相比,GSK2606414和STF-083010处理均能降低病毒感染细胞的LC3II/LC3I蛋白表达比值,而AEBSF未能降低病毒感染细胞的LC3II/LC3I蛋白表达比值。这表明在PEDV感染通过PERK和IRE1信号通路调控自噬的发生。为了解自噬与PEDV复制之间的关系,将自噬激活剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA作为对照,PERK抑制剂GSK2606414和IRE1抑制剂STF-083010处理PEDV感染的Vero细胞,通过western blot、RT-q PCR和TCID50检测病毒增殖情况。结果显示,与PEDV病毒感染细胞相比,雷帕霉素促进PEDV复制,而3MA、GSK2606414和STF-083010降低PEDV复制。结果提示PEDV感染诱导自噬并通过PERK和IRE1通路促进病毒复制。活性氧（reactive oxygen species,ROS）在多种信号通路的调控中发挥着重要作用。使用活性氧清除剂N-acetylcysteine（NAC）来研究ROS在PEDV感染诱导的内质网应激和自噬过程中的作用。Western blot分析结果显示,与病毒感染组相比,NAC处理降低病毒感染细胞中GRP78的蛋白表达水平和LC3II/LC3I的比值,提示ROS在调控内质网应激和自噬的过程中发挥着重要的作用。综上所述,本研究证实PEDV感染Vero细胞诱导ROS依赖的内质网应激,并通过UPR信号通路中的PERK/e IF2和IRE1/JNK途径调控自噬的发生,进而促进PEDV的复制。