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牙鲆是我国重要的经济鱼种之一,它胚后有一个特殊的变态发育过程,在这期间形态和生活习性上都有一个极大的转变,死亡率较高,因此研究牙鲆变态发育以降低其死亡率可以直接提高牙鲆的产量。牙鲆变态发育中骨骼形态发生了巨大的改变,骨骼发育过程中有明显的增生、消融和迁移的现象,但在这方面的研究目前还较少。
本研究采用骨骼三重染色的方法对牙鲆仔鱼从变态发育前至变态发育结束的五个时期的仔鱼进行整体染色,以期对牙鲆变态发育期间其骨骼发育情况进行系统分析。利用不同的颜色清晰地标识出牙鲆变态发育期间软骨和硬骨的分化、迁移和生长的过程以及牙鲆右眼移位中神经的迁移方向以及变态发育后神经的分布情况。结果表明,牙鲆变态前期仔鱼软骨比例较高,随着发育的进行,软骨明显发生迁移和体积缩小,与此同时,硬骨则逐渐发育成熟。
此外,为进一步研究骨骼发育分化的机理,本研究克隆了牙鲆Bmp4、Sox9和Bmp2基因,并对其在变态发育过程不同时期仔鱼和成鱼不同组织的表达进行了半定量研究,以探索这些基因的时空表达特征。对不同时期仔鱼的半定量RT-PCR结果表明,未检测到Bmp2基因在胚胎和仔鱼阶段的表达;Bmp4在仔鱼阶段有少量表达且总体上随着牙鲆的变态发育其表达量呈递减趋势;Sox9在仔鱼阶段表达量较高,在出膜后仔鱼中表达量先升高,后随着变态发育的发生,软骨分化结束表达量递减。通过荧光定量的结果分析,Bmp4和Sox9在仔鱼阶段的前三个时期以约15%的量递减,在变态Ⅳ期也就是牙鲆右眼移至头顶、形态发生巨大转变的变态高峰期表达量有显著降低,只有Ⅲ期表达量的20%。对成鱼肝脏,肠道,鳃,肾脏和皮肤进行半定量RT-PCR研究表明,Bmp2和Sox9基因在肝脏,肠和鳃中均表达,而在鳃中的表达量最高且Sox9基因表达量高于Bmp2基因;Bmp4基因除肝脏以外的组织中均有表达但表达量较低,而在肾脏和皮肤中表达量相对较高。
本文为研究牙鲆变态发育期间骨骼发育和分化提供了形态学和分子生物学依据,并为进一步研究成鱼中与骨骼发育相关基因的调控机制和相互关系奠定了一定的基础。