Protectin DX抑制中性粒细胞活化减轻脓毒症小鼠急性肺损伤及其机制

来源 :华中科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qiuyu19900318
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第一部分PDX对脓毒症小鼠急性肺损伤的影响
  目的:探讨不同剂量ProtectinDX(PDX)对脓毒症诱导的小鼠急性肺损伤的影响。
  方法:依据手术方式及给药与否将28只6-8周雄性SPF级C57小鼠随机分为4组,每组各7只小鼠:(1)假手术组(Sham):沿腹中线将小鼠腹腔打开,再逐层缝合,术后1h经腹腔注射100μlPBS;(2)脓毒症组(CLP):采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)建立小鼠脓毒症模型术,术后1h经腹腔注射100μlPBS;(3)CLP+PDX500ng组:建立CLP模型后,术后1h经腹腔注射500ngPDX(溶于100μlPBS);(4)CLP+PDX1000ng组:建立CLP模型后,术后1h经腹腔注射1000ngPDX(溶于100μlPBS);24h后经腹主动脉放血处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid , BALF)和肺组织标本。采用HE染色观察肺组织病理变化并进行肺损伤评分;测定小鼠肺组织湿/干重比(W/D),BALF中的蛋白浓度和细胞分类计数;ELISA法检测BALF中白介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α)、和巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)的浓度。
  结果:与Sham组比较,CLP组小鼠肺组织病理损伤明显,肺损伤评分、干湿比及BALF中的蛋白浓度、总细胞数量、中性粒细胞数量及炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2)浓度明显增加;与CLP组相比,给予PDX明显改善肺组织病理损伤、降低肺损伤评分、干湿比、BALF中的蛋白浓度、总细胞数量、中性粒细胞数量及炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2)浓度。PDX高剂量组与低剂量组相比,肺组织病理损伤及评分、干湿比以及BALF蛋白浓度均更低,BALF中的IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2水平更低。
  结论:PDX能减轻脓毒症诱导的小鼠急性肺损伤与肺水肿,减少炎症细胞的聚集以及炎症因子的释放。
  第二部分PROTECTINDX通过调节中性粒细胞活化保护脓毒症小鼠急性肺损伤
  目的:探讨PDX是否通过调节中性粒细胞活化对脓毒症致急性肺损伤产?作?。
  方法:第一部分:依据手术方式及给药与否将28只6-8周雄性SPF级C57小鼠随机分为4组,每组各7只小鼠:(1)假手术组(Sham):沿腹中线将小鼠腹腔打开,再逐层缝合,术后1h经腹腔注射100μlPBS;(2)脓毒症组(CLP):采用CLP法建立小鼠脓毒症模型术,术后1h经腹腔注射100μlPBS;(3)CLP+PDX500ng组:建立CLP模型后,术后1h经腹腔注射500ngPDX(溶于100μlPBS);(4)CLP+PDX1000ng组:建立CLP模型后,术后1h经腹腔注射1000ngPDX(溶于100μlPBS);24h后经腹主动脉放血处死小鼠,收集肺组织标本。以2,7-二氯氢化荧光素二酯(DCFH-DA)为探针,检测肺组织中活性氧(reactive oxygen species , ROS )水平;采用WST-1法测定肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,SOD)活力;采用TBA法检测肺组织匀浆中的丙二醛(malondialdehyde ,MDA)水平;采用免疫组化及免疫荧光法检测肺组织中中性粒细胞浸润情况。第二部分:将健康成人外周血中提取的中性粒细胞体外培养,随机分为5组:(1)对照(Control)组:培养基中加入PDX的溶剂PBS作为对照组;(2)LPS组:培养基中加入1μg/ml的LPS;(3)LPS+PDX10nM组:1μg/mlLPS刺激细胞1h后,加入10nMPDX;(4)LPS+PDX100nM组:1μg/mlLPS刺激细胞1h后,加入100nMPDX;(5)LPS+PDX1000nM组:1μg/mlLPS刺激细胞1h后,加入1000nMPDX。24小时后,离心分离细胞与上清,采用ELISA法检测细胞上清中炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2)及髓过氧化氢酶(Myeloperoxidase,MPO)、采用微板法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的表达水平、采用WST-1检测细胞上清中SOD表达水平;以DCFH-DA为探针,检测细胞中ROS表达水平。
  结果:第一部分:与Sham组比较,CLP组小鼠肺组织ROS和MDA含量明显增加,SOD含量显著减少,肺组织中中性粒细胞大量聚集;与CLP组相比,PDX明显降低了小鼠肺组织ROS和MDA含量,提高了SOD含量,中性粒细胞浸润显著减少。PDX高剂量组与低剂量组相比,小鼠肺组织ROS和MDA含量明显减少,SOD含量明显增加,中性粒细胞浸润显著减少。第二部分结果表明:与Control组相比,LPS刺激中性粒细胞分泌大量炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2),MPO、LDH及ROS表达水平显著增加,SOD表达水平明显下降;PDX呈剂量依赖性的降低炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2)、MPO、LDH及ROS的表达水平,SOD的表达水平则明显增加。
  结论:PDX通过抑制中性粒细胞活化来减轻脓毒症诱导的小鼠急性肺损伤。
  第三部分PROTECTINDX调节中性粒细胞活化的可能机制
  目的:探讨PDX调节中性粒细胞活化的可能分?机制。
  方法:第一部分:依据手术方式及给药与否将28只6-8周雄性SPF级C57小鼠随机分为4组,每组各7只小鼠:(1)假手术组(Sham):沿腹中线将小鼠腹腔打开,再逐层缝合,术后1h经腹腔注射100μlPBS;(2)脓毒症组(CLP):采用CLP法建立小鼠脓毒症模型术,术后1h经腹腔注射100μlPBS;(3)CLP+PDX500ng组:建立CLP模型后,术后1h经腹腔注射500ngPDX(溶于100μlPBS);(4)CLP+PDX1000ng组:建立CLP模型后,术后1h经腹腔注射1000ngPDX(溶于100μlPBS);24h后经腹主动脉放血处死小鼠,收集肺组织标本,采用免疫印迹法检测肺组织p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-NF-κBp65、p-p47phox-ser345的水平。第二部分:将健康成人外周血中提取的中性粒细胞体外培养,随机分为5组:(1)对照(Control)组:培养基中加入PDX的溶剂PBS作为对照组;(2)LPS组:培养基中加入1μg/ml的LPS;(3)PDX10nM组:1μg/mlLPS刺激细胞1h后,加入10nMPDX;(4)PDX100nM组:1μg/mlLPS刺激细胞1h后,加入100nMPDX;(5)PDX1000nM组:1μg/mlLPS刺激细胞1h后,加入1000nMPDX。24h后分离出细胞,免疫印迹法检测p-p38,p-ERK1/2,p-NF-κBp65、p-p47phox-ser345的表达水平。
  结果:第一部分结果表明CLP诱导p-p38,p-ERK1/2,p-NF-κBp65、p-p47phox-ser345磷酸化水平增加,PDX能够显著降低磷酸化水平。第二部分结果表明:LPS刺激中性粒细胞表达p-p38,p-ERK1/2,p-NF-κBp65、p-p47phox-ser345的表达明显增多,PDX呈剂量依赖型地减少p-p38,p-ERK1/2,p-NF-κBp65、p-p47phox-ser345的表达。
  结论:PDX能够抑制CLP或LPS诱导的中性粒细胞活化,其机制可能通过MAPK/NF-κB/p47phox-ser345信号通路。
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