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研究目的:本研究旨在体外及体内发现miR-185-5p,c-MYC,NK1R-Tr三者之间的相互表达调控关系,及相互调控对乳腺癌细胞侵袭和转移的影响,为乳腺癌的基础研究、防治和其个体化或预见性治疗提供更为详尽的证据。研究方法:1.组织和细胞系表达研究选取了2014-2015年来自天津医科大学肿瘤医院100例乳腺癌患者手术切除的乳腺癌及癌旁组织,这些病人均经病理确诊为乳腺癌。通过Western blot/RT-PCR分析NK1R、c-MYC、miR-185-5p在癌组织以及癌旁组织中的表达情况,并采用t检验对癌组织和癌旁组织,转移/未转移,TNMⅠ~Ⅱ期/Ⅲ~Ⅳ期中NK1R、c-MYC、miR-185-5p的表达差异进行统计分析;采用Western blot/RT-PCR检测不同乳腺癌细胞系中NK1R/c-MYC的蛋白/mRNA表达水平以及miR-185-5p的表达水平。2.c-MYC对NK1R-Tr的调控研究通过JASPAR软件预测发现在NK1R-Tr的启动子区域存在c-MYC的结合位点,并采用染色质免疫共沉淀技术验证c-MYC是否结合于NK1R-Tr的启动子区域,然后采用荧光素酶报告基因实验验证c-MYC对NK1R-Tr的具体调控作用。最后通过Western blot/RT-PCR检测MDA-MB-231细胞中干扰和过表达c-MYC后NK1R-Tr蛋白/mRNA水平的改变。3.miR-185-5p调控NK1R-Tr并影响乳腺癌细胞的生物学功能采用生物信息学预测发现NK1R-Tr的3’UTR区有miR-185-5p的结合位点,并在HEK293T、MDA-MB-231和SK-BR-3细胞系中利用荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-185-5p是否通过靶向作用于NK1R-Tr的3’-UTR区调控其转录。在MDA-MB-231、T47D乳腺癌细胞系中瞬时转染miR-185-5p mimic/negative control,在SK-BR-3乳腺癌细胞系中瞬时转染miR-185-5p inhibitor/negative control,通过Western blot、RT-PCR检测NK1R-Tr的mRNA及蛋白水平、miR-185-5p水平的改变。SP刺激同时,在MDA-MB-231乳腺癌细胞系中瞬时转染mi R-185-5p mimic/negative control,并用NK1R-Tr的过表达质粒进行拯救;在SK-BR-3乳腺癌细胞系中瞬时转染miR-185-5p inhibitor/negative control,并用NK1R-Tr siRNA进行拯救,通过Western blot验证细胞系中NK1R-Tr的表达情况;采用CCK8实验、克隆形成实验、EDU增殖实验、流式细胞术细胞周期检测、transwell体外迁移侵袭实验验证SP刺激下,miR-185-5p是否是通过NK1R-Tr对乳腺癌细胞的增值、侵袭迁移、克隆形成能力产生影响。4.c-MYC可能通过miR-185-5p间接调控NK1R-Tr通过JASPAR预测发现c-MYC在miR-185-5p的启动子区存在多个结合位点,在MDA-MB-231乳腺癌细胞系中干扰c-MYC后,RT-PCR检测miR-185-5p的表达水平改变;Western blot/RT-PCR验证抑制内源性的miR-185-5p是否影响c-MYC对NK1R-Tr蛋白及mRNA水平的影响。5.c-MYC调控SP诱导的Erk1/2的激活在四种不同处理(敲除c-MYC/对照,NK1R受体拮抗剂/对照37℃孵育30min)的乳腺癌细胞系中,用NK1R的配体SP(10-7M)分别刺激不同的时间段(0min,30min,120min,150min),Western blot检测Erk1/2的激活情况。6.miR-185-5p体内抑制肿瘤细胞生长和乳腺癌细胞的转移使用稳定性修饰的miRNA激动剂miR-185-5p agomir及其对照agomir control孵育MDA-MB-231、特殊修饰的miRNA拮抗剂miR-185-5p antagomir及其antagomir control孵育SK-BR-3。行SCID鼠腹股沟注射成瘤实验和尾静脉注射血道转移实验。每周对瘤块进行测量,于注射后5-7周,切除小鼠的瘤块和肺组织,石蜡切片进行HE染色,分析肺转移情况,对瘤块的长宽径进行测量并拍照进行比较。研究结果:1.组织和细胞系表达研究NK1R-Tr、c-MYC在癌组织中表达明显高于癌旁组织,而miR-185-5p的表达趋势正相反;转移组NK1R-Tr和c-MYC的mRNA表达水平高于未转移组,而miR-185-5p低于未转移组;TNM分期Ⅰ~Ⅱ期中NK1R-Tr和c-MYC的mRNA表达水平明显低于Ⅲ~Ⅳ期组,而miR-185-5p高于Ⅲ~Ⅳ期组。在高侵袭转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231中miR-185-5p表达量较低,而NK1R-Tr、c-MYC的表达量较高,而在侵袭转移能力较弱的SK-BR-3中miR-185-5p表达量较高,而NK1R-Tr、c-MYC的表达量较低。2.c-MYC对NK1R-Tr的调控作用c-MYC确实结合于NK1R-Tr启动子区域并对NK1R-Tr起到正性调节的作用。干扰c-MYC后,NK1R-Tr的mRNA水平和蛋白水平均降低,而过表达c-MYC后NK1R-Tr的mRNA和蛋白水平均升高。3.miR-185-5p调控NK1R-Tr并影响乳腺癌细胞的生物学功能miR-185-5p靶向作用于NK1R-Tr的3’UTR区抑制其转录活性。在MDA-MB-231乳腺癌细胞系中高表达miR-185-5p后可抑制NK1R-Tr mRNA和蛋白水平的表达,在SK-BR-3乳腺癌细胞系中抑制内源性miR-185-5p后可促进NK1R-Tr mRNA和蛋白水平的表达。SP刺激下,过表达miR-185-5p后,MDA-MB-231乳腺癌细胞系的生长速度减慢,克隆形成能力减弱,G2/S期细胞比例降低,阻滞在G1期,侵袭迁移能力减弱,使用NK1R-Tr过表达质粒进行拯救之后可恢复,同时在SK-BR-3中抑制miR-185-5p后可得到相反的结果。4.c-MYC可能通过miR-185-5p间接调控NK1R-Trc-MYC可抑制miR-185-5p的表达,并且通过miR-185-5p间接作用于NK1R-Tr调控其表达。5.c-MYC调控SP诱导的Erk1/2的激活c-MYC可作用于NK1R-Tr从而进一步激活Erk1/2通路,进而对乳腺癌的增殖侵袭等起到促进作用。6.miR-185-5p体内抑制肿瘤生长和乳腺癌细胞的转移过表达miR-185-5p后乳腺癌细胞的成瘤能力及生长速度减弱,相反抑制内源性miR-185-5p后成瘤能力及生长速度增强;过表达miR-185-5p后相比对照组乳腺癌细胞的转移能力减弱,肺转移灶减少,小鼠肺转移率降低,与此同时,抑制内源性miR-185-5p后可得到相反的结果。研究结论:在乳腺癌组织中NK1R-Tr、c-MYC高表达,miR-185-5p低表达,NK1R-Tr/c-MYC与miR-185-5p成负相关;c-MYC直接或间接通过miR-185-5p调控NK1R-Tr的表达,并进一步通过激活Erk1/2通路,进而对乳腺癌的增殖侵袭等起到促进作用。miR-185-5p靶向作用于NK1R-Tr影响乳腺癌细胞的增殖、细胞周期以及侵袭转移,体内抑制乳腺癌细胞的成瘤能力以及肺转移。c-MYC、NK1R-Tr、miR-185-5p形成了一个回路在乳腺癌的发展中起到重要的调节作用。