丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是丙型肝炎的病原体。近年来,HCV分子生物学研究进展包括HCV基因组结构与功能的进一步阐明和HCV与宿主相互作用的宿主影响因素的明确,加之高通量测序等技术的飞速发展,为HCV感染控制的基础研究提供了技术手段和研究新思路。研究新发现HCV含有与宿主细胞微小RNA(microRNA或miRNA)相互作用的调控序列,对HCV在肝细胞中复制和翻译具有重要的调控作用,这为控制丙型肝炎疾病进展及开发新型药物研究提供了新途经。MicroRNA是一类长约19-22个核苷酸的非编码微小RNA,广泛存在于动物细胞中,具有高度的保守性,可以调控转录后水平的靶基因的表达。mi R-122是一种专一性地在肝细胞及肝癌细胞系Huh-7细胞中表达的microRNA。研究表明,mi R-122具有广泛的生理功能,参与肝细胞的发育、细胞表型、分化代谢以及肝细胞免疫反应等各种基本生命活动过程。病理状态下,mi R-122有促进HCV复制和翻译的作用,还可促进肿瘤细胞的凋亡,在HCC的发生及发展过程中发挥抑癌基因样的功能。miR-122通过降低减少脂质相关蛋白m RNA调节脂质代谢。也能通过抑制细胞质多聚腺苷酸结合蛋白(toplasmic polyadenylation element binding protein,CPEB)激活p53 m RNA的翻译,参与细胞衰老。当含HCV RNA双顺反子复制子的Huh-7细胞的mi R-122被阻抑后,复制子RNA水平下降约80%;当内源性mi R-122被阻抑后,具有复制能力的复制子转染细胞后则不能复制,所以mi R-122对维持细胞内病毒丰度是必须的。尽管系统的RNA干扰筛查发现了数十种宿主基因编码蛋白与HCV RNA或蛋白或与调节HCV复制相关的宿主途经相互作用,由于miR-122是高度的肝特异性表达的microRNA,其占肝脏总microRNA含量的70%,故mi R-122在HCV复制与翻译过程中发挥了关键作用,也可能在翻译调节水平上与HCV趋肝性有关。本课题根据文献报道及预测target gene比较权威的数据库:http://pictar.mdc-berlin.de/及http://www.targetscan.org/对miR-122可能调控的靶基因进行预测,发现STAT3的3′-UTR和miR-122有特异性结合位点。STAT3作为信号转导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)蛋白家族的成员,在维持胚胎干细胞的全能性及免疫调节中发挥重要作用。stat3可以被多种信号激活,如细胞因子(il-2、il-6、il-10、il-11、il-23、il-21、lif)、生长因子(egf、vegf、hgf、cntf)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor,gcsf)、感染因素或者应激刺激肾上腺素受体等。stat3在人类多种恶性肿瘤中呈高水平的激活状态,其异常表达与多种疾病及病毒感染密切相关。神经胶质瘤细胞中,磷酸化的stat3可增强溶瘤单纯疱疹病毒(oncolyticherpessimplexvirus,ohsv)的复制效率和细胞毒性。eb病毒(epstein–barrvirus,ebv)感染后,stat3的表达迅速上调,导致细胞分裂中断的丧失,促进细胞增殖,可导致癌症的发生。已有研究发现hcvrna的复制可增强stat3的磷酸化,而磷酸化的stat3通过调节微管动力学促进hcv的复制。同时hcvc蛋白可以调节nanog基因的表达,nanog基因是dna结合转录因子家族中的一员,是一种多能性基因,在调节干细胞的增殖中发挥了重要作用。通过磷酸化stat3,hcvc蛋白可增强nanog基因的表达,促进细胞生长和细胞周期的进展。本研究中也发现,stat3的磷酸化可促进hcvrna的复制效率,并具有时间依赖性和剂量依赖性。stat3的磷酸化在hcv复制过程中扮演了十分重要的角色,并可诱导特定基因的表达,在宿主体内创造出有利于hcv复制的环境。非编码rna(non-codingrnas,ncrna)是一大类不编码蛋白质但在细胞中起到调控作用的rna分子,主要包括小rna和长链rna。最近的研究发现,ncrna的突变及异常表达常与多种疾病密切相关,因此非编码rna引起广泛关注。其中非编码长链rna(longnon-codingrnas,lncrnas)指的是长于200核苷酸的不编码蛋白质的转录因子,参与了机体内多种生理机能的调控,同时多种疾病也和lncrnas的异常表达密切相关。机体感染hiv-1后,lncrnas家族中neat1蛋白表达异常,而neat1基因的抑制又增强hiv的复制。近年来的研究证实lncrnas和hcv感染导致的肝细胞癌(hcc)的发生密切相关。此外,lnc-dc特异的在人树突细胞(dendriticcells,dcs)中表达,参与了dc的分化,并通过和stat3的相互作用激活t细胞应答。在ifn应答中,lncrna-cmpk2作为负调控因子,参与isgs抗病毒的抑制作用。ifn诱导rna-capk2基因表达可抑制病毒介导的免疫反应,是其负向调节因子,由此可见lncrnas对宿主的免疫应答具有重要的调控作用。根据文献报道,lncrna的研究主要集中在各种癌症,而lncrna与病毒关系的研究鲜有报道。有研究报道了lncrna与hcv或hbv诱发的肝细胞癌之间的相互关系,但其具体机制仍不清楚。因此,阐明长链非编码rna与病毒的关系将会为研究病毒感染性疾病提供新的证据与手段。本课题以肝脏特异mir-122为切入点,根据文献报道及生物信息学分析预测得到与mir-122有特异性结合位点的靶基因stat3,证实mir-122在huh-7细胞中靶向作用于stat3基因的3′-utr抑制其表达,而hcv竞争结合mir-122可上调stat3的表达,抑制i型干扰素表达,从而抑制细胞抗病毒免疫反应,增强hcvrna的复制。同时,对lncrnapcrarray法检测得到stat3激活时上调最显著的lethe基因进行进一步的研究。lethe,作为“假基因”lncrna,可被nf-κb(多种蛋白的复合体)或者糖皮质激素受体激动剂激活,调控炎症信号,遏制炎症反应。研究发现huh-7细胞经过stat3激活因子lif预处理后,lncrna-lethe表达显著上调。同时,感染hcvrna的huh-7细胞中lethe表达显著上调,而lethe基因的沉默可导致hcv复制子复制复制效率降低,证实stat3可以正向调控lncrna-lethe基因,促进hcvrna的复制。转染lethesirna后,huh-7细胞内干扰素刺激基因(ifn-stimulatedgene,isgs):pkr,oas和irf1蛋白质水平表达量上调,real-timepcr检测结果显示,其相应的mrna水平表达量上调。提示rna-lethe可通过调节i型ifn的免疫反应,在hcv的复制及致病过程中起到了关键的作用。研究获得了两个新的发现:1)stat3可上调lnc-lethe表达,促进hcv病毒的复制;2)lnc-lethe通过调节Ⅰ型干扰素反应调控hcv的复制。初步探讨了mir-122、stat3、lncrna-lethe在hcv复制和宿主免疫应发之间的相互关系,为hcv的防治提供了理论基础和新的途径。主要研究结果一、mir-122和stat3的特异结合抑制stat3的表达生物信息学软件targetscan在线预测发现:stat3mrna和mir-1223’-utr端碱基(ugaggu)靶向结合。为了验证stat3是否为mir-122的直接靶基因,构建了质粒pgl3-stat3(包含stat33’-utr567bp片段)及pgl3-stat3-mu(包含stat33’-utr5个突变位点)。pgl3-stat3质粒分别同mir-122mimic、mir-122inhibitor共转染huh-7细胞。利用双荧光素酶报告系统对结果进行分析。相对对照组,mir-122mimic导致stat3表达降低42.1%,而mir-122inhibitor则增强stat3表达(38.4%)。为了进一步验证mir-122和stat3的结合靶位,质粒pgl3-stat3和pgl3-stat3-mu分别转染huh-7细胞,双荧光素酶报告系统分析显示,相对野生株stat3质粒,mir-122突变株质粒荧光表达显著增强(56.2%,p<0.05)。以上数据表明mir-122通过和stat33’-utr区种子匹配序列的特异结合抑制stat3的表达,提示stat3是mir-122的直接靶基因。二、hcvrna可能通过和mir-122的靶向结合,保护或增强stat3的表达利用复制子pcdna3.1-rz-hcvrna1b(包含hcv1b型9658bp)及pcdna3.1-rz-hcvrna1b-mu(包含hcv1b型9658bp,hcv5’-utrmir-122“种子序列”区3个位点突变)瞬时转染huh-7细胞。24h后qrt-pcr检测mir-122含量发现,相对突变株,hcvrna野生株mir-122的量略有减少,但差距并不显著,这也说明微量的mir-122即可影响hcvrna的复制。24h后westernblot检测stat3蛋白表达发现,hcvrna野生株转染体系中,其表达相对hcvrna突变株显著上调。提示hcvrna可通过和mir-122的靶向结合,保护或增强stat3的表达。三、hcvrna通过增强stat3蛋白表达,抑制ifn-α和ifn-β表达,降低抗病毒应答通常认为stat3可负向调节ifn介导的抗病毒反应。stat3基因的沉默或敲减可激活ifn-α和ifn-β介导的抗病毒反应。本研究在hcvrna野生株和hcvrna突变株的瞬时转染体系中,分别在转染后0h,4h,8h,12h,24h四个时间点,利用qrt-pcr检测ifn-α和ifn-β表达。结果显示,hcvrna野生株转染细胞体系中,ifn-α和ifn-β的表达显著降低,而hcvrnamir-122突变株和对照组差异不显著。提示hcvrna和mir-122的靶向相结合,可增强stat3蛋白表达,抑制ifn-α和ifn-β表达,从而降低抗病毒应答。四、stat3的磷酸化促进hcvrna复制白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,lif)作为stat3的外源性细胞因子激活剂加入huh-7细胞培养基,不同孵育时间刺激后转染染hcvjfh-1质粒,qrt-pcr检测hcvrna水平发现hcvrna增加和lif刺激时间相关。不用浓度lif刺激huh-7细胞,可不同程度促进hcvrna复制。同样,hcv的ns5a和ns3蛋白表达水平显著增加。stat3磷酸化抑制剂ag490使细胞内stat3-y705水平显著降低,hcvrna及蛋白表达也降低。提示stat3的磷酸化在hcv的复制中扮演了十分重要的角色,可诱导特定基因的表达,在宿主体内创造出有利于hcv复制的环境。五、huh-7细胞中磷酸化stat3可调控lncrna利用lncrnapcrarray检测lif刺激磷酸化stat3组和空白对照组细胞中的lncrna表达的差异,差异标准为相对对照组2倍以上的增加或降低。发现多条lncrna的表达水平发生了变化。有文献报道lncrnalethe能够调控i型干扰素介导的先天性免疫,而lethe在磷酸化stat3的细胞中差异倍数最显著,因此选其为研究对象进一步研究。lif刺激huh-7细胞后,lethemrna的表达水显著上调,而ag490刺激后,huh-7中lethe表达量显著下降。为了研究hcv感染能否调控lethe的表达,对不同分组(hcv感染组、hcv+ag490组、hcv+lif组以及空白对照组)进行研究。与空白对照组相比较,hcv感染细胞后能显著上调lethe的表达(4倍);在hcv感染的细胞中同时利用ag490抑制stat3的磷酸化,则lethe的上调被显著抑制,甚至低于空白对照组;在hcv感染的细胞中同时利用lif进一步促进stat3的磷酸化,lethe的表达水平进一步上升。实验结果表明:hcv感染细胞后能通过促进stat3的磷酸化上调lethe的表达。六、huh-7细胞中lncrna-lethe的干扰可抑制hcv复制三条lethesirna及对照sirna分别转染huh-7细胞,qrt-pcr结果显示三条靶向lethe的sirna均在不同程度上抑制lethe表达,其中si-lethe-3的抑制效果最明显。huh-7细胞转染si-lethe-3后,再感染hcvjfh-1。相对对照组,hcvrna水平降低,ns5a和ns3蛋白表达降低。为了进一步确定磷酸化的stat3通过lethe促进hcv复制,我们设计了实验进行研究。实验分组如下:lif刺激组、lif+sirna-control组、lif+si-lethe组和空白对照组。与空白对照组相比较,lif刺激组能显著上调hcvns5a转录;lif刺激同时敲减lethe后,hcvns5a转录水平显著下调。结果表明:诱导stat3磷酸化能够显著促进hcv复制,磷酸化的stat3可能通过上调lncrnalethe促进hcv复制。七、lncrna-lethe通过抑制i型干扰素介导的免疫应答促进hcv复制在hcv感染的huh-7细胞中加入lethesirna后,huh-7细胞内i型干扰素分子pkr,oas和irf1蛋白表达显著上调,细胞内相应的mrna表达水平上调。为进一步确定hcv诱导磷酸化的stat3在上述lethe对i型干扰素分子的调控中的作用。我们对不同实验分组(lif刺激组、lif+sirna-control组、lif+si-lethe组和空白对照组)进行了研究。与空白对照组比较,lif刺激细胞后能显著下调i型干扰素分子pkr,oas和irf1的表达;在lif刺激的细胞中同时干扰lethe后,i型干扰素分子pkr,oas和irf1的表达水平达到最大。结果表明:lif抑制i型干扰素分子pkr,oas和irf1的表达是通过上调lethe介导的。主要结论:1.hcv与stat3竞争结合mir-122抑制i型干扰素介导的抗病毒机制,促进hcvrna的复制。2.stat3可以正向调控lncrna-lethe基因,促进hcvrna的复制。3.RNA-Lethe可通过调节I型IFN的免疫反应,在HCV的复制及致病过程中起到了关键的作用