论文部分内容阅读
第一部分LPS-mi R-132/212-SIRT1通路在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎中的表达变化目的探讨脂多糖LPS（lipopolysaccharide）、mi R-132/212、sirtuin1（SIRT1）在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎（Hirschsprung-associated enterocolitis,HAEC）中的表达变化及其在HAEC发生中的作用。方法收集64例先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease,HSCR）患儿肠道组织标本,按照术后是否伴有HAEC分成两组,一组为32例术后HAEC,一组为32例单纯HSCR。通过实时荧光定量PCR（RT-q PCR）及免疫印迹试验（Western Blot）检测mi R-132/212及SIRT1的表达,同时采用Person相关性分析、细胞转染、分子表达调控及双荧光素酶报告基因鉴定SIRT1是mi R-132/212的靶基因。利用工具细胞HT-29培养及细胞转染,探讨LPS对mi R-132/212及其靶基因SIRT1表达的影响。结果在HAEC中mi R-132/212的表达呈现明显高表达状态,采用Target Scan、Pic Tar和mi R-base等预测网站对mi R-132/212进行生物信息学分析,结合已有研究报道,发现mi R-132/212首选调控的下游潜在靶基因为SIRT1,且HAEC组中SIRT1的表达显著低于单纯HSCR组。并且mi R-132/212与SIRT1在m RNA水平的表达呈现负相关,并且存在结合关系,证实SIRT1为mi R-132/212的共同靶基因。采用LPS按照浓度梯度孵育HT29细胞提示LPS可以调控mi R-132/212及其靶基因SIRT1的表达,参与HAEC的发生。结论mi R-132/212及其靶基因SIRT1参与HAEC的发生,并提示LPS可能通过mi R-132/212调控SIRT1表达发挥作用。第二部分LPS通过mi R-132/212介导NLRP3炎性小体影响细胞焦亡在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎发病中作用目的HAEC是在巨结肠的基础上并发的急性肠道炎症,细胞焦亡（pyroptosis）与炎症息息相关,本研究旨在探讨LPS诱导肠上皮细胞焦亡,进而参与HAEC的发生发展,并进一步研究其具体作用机制。方法采用RT-q PCR及Western Blot实验检测32对术后HAEC及单纯HSCR患儿肠道组织中NLRP3、ASC及活化Csapsae-1的表达水平。将人肠上皮工具细胞HT29暴露于不同浓度LPS中,建立LPS细胞损伤模型。分别转染mi R-132/212拟似物（mimics）、抑制物（inhibitor）及SIRT1过表达质粒对细胞内相应的分子进行调控,通过RT-q PCR、Western Blot及细胞免疫荧光实验检测NLRP3、ASC及活化Csapsae-1的表达,流式细胞进行体外细胞焦亡挽救实验,鉴定LPS可能通过调控mi R-132/212-SIRT1通路,诱导NLRP3表达,激活Caspase-1,介导肠上皮细胞焦亡。结果细胞焦亡相关基因NLRP3、ASC及Caspase-1在HAEC患儿肠道组织中均显著高表达。通过细胞LPS暴露及mi R-132/212 mimics转染发现LPS及mi R-132及mi R-212均可以诱导NLRP3、ASC及Caspase-1的表达升高,而低表达mi R-132、mi R-212或过表达SIRT1可以部分扭转LPS导致的细胞焦亡相关基因表达。最后通过流式细胞实验,以活化Caspase-1作为细胞焦亡标志物进行流式细胞测定分析,结果观察到LPS可以明显促进HT29细胞中Caspase-1的活性,而mi R-132和mi R-212 inhibitor或SIRT1过表达质粒转染细胞均可以降低这种影响。结论LPS通过调控mi R-132/212-SIRT1通路,诱导NLRP3表达及Caspase-1活化,促进肠上皮细胞焦亡,从而参与先天性巨结肠相关小肠结肠炎的发生。第三部分在体研究LPS-mi R-132/212-SIRT1介导的细胞焦亡在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎中的作用机制研究目的使用LPS诱导肠道炎症小鼠模型进一步验证LPS是否可以通过mi R-132/212降低SIRT1的表达,促进NLRP3炎性小体的激活,介导细胞焦亡。方法研究组采用C57BL/6小鼠（20±2 g,6-8周龄）作为LPS小鼠模型,使用LPS对小鼠进行腹膜注射,分为LPS实验组及对照组。小鼠模型鉴定采用HE染色及ELISA实验。通过RT-q PCR及Western Blot分别检测LPS小鼠肠道炎症模型肠组织中mi R-132、mi R-212、SIRT1的表达以及焦亡相关因子NLRP3、ASC及活化Caspase-1的表达。结果相对于对照组,LPS组小鼠HE染色中小肠绒毛部分丢失,黏膜下层和固有层分离,同时炎性细胞聚集,LPS组中炎症因子IL-18及IL-1β的表达明显高于对照组,提示肠道炎症小鼠模型造模成功。进一步采用RT-q PCR及Western Blot检测发现LPS组小鼠肠组织中mi R-132及mi R-212表达明显上升,而靶基因SIRT1的m RNA及蛋白表达下降,同时焦亡相关基因NLRP3、ASC及活化Caspase-1的表达均呈现高表达水平。结论进一步采用体内实验验证LPS可能通过mi R-132/212调控靶基因SIRT1表达,激活NLRP3炎性小体,介导肠上皮细胞焦亡,从而参与先天性巨结肠相关小肠结肠炎的发生。