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目的了解携带blaIMP-4肠杆菌目细菌的耐药性、分子特征及毒力因子,探索不同抗生素对治疗携带blaIMP-4肠杆菌的最佳方案,以及质粒在肠杆菌中水平转移的机制,旨在能够为质粒介导的耐药传播发展新一代预防措施提供思路,在碳青霉烯耐药菌的治疗选择方面提供实验室依据。方法收集两所三级甲等教学医院分离的耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)共259株,其中筛选出4株IMP-4碳青霉烯酶阳性菌株。1、用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测相关耐药基因:β-内酰胺类基因、Amp C酶编码基因、质粒介导的喹诺酮耐药基因、多粘菌素耐药基因。2、肉汤稀释法检测最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。3、棋盘滴定法和时间杀伤试验来探究不同抗生素治疗携带blaIMP-4基因的CRE的最优组合。4、采用生物膜形成试验和血清杀伤试验来检测携带blaIMP-4毒力强弱。5、采用接合试验、自然传代法及SDS-高温交替法来验证质粒的转移及稳定性。6、利用全基因组测序技术检测耐药基因、毒力基因、耐药质粒的详细信息、多位点序列分型(MLST)及IV型分泌系统(Type IV secretion system,T4SS)的组成。7、利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR)检测接合基因tra D的表达量。结果1、检出blaIMP-4(3株)以及blaIMP-26(1株)碳青霉烯类耐药基因,还检出mcr-9、blaSHV、blaTEM、blaDHA、acc(6’)-lb和blaOXA-1耐药基因,未检出blaKPC、bla NDM、blaVIM、blaACC及blaCTX-M耐药基因。2、所有分离株均对美罗培南(MEM)、多粘菌素(PB)、亚胺培南(IMP)、头孢他啶-阿维巴坦(CAZ-AVI)耐药,对替加环素(TIG)、阿米卡星(AK)、左氧氟沙星(LEV)耐药率均为25%(1/4)。3、MEM+LEV联合对CRECL42的FICI值为0.25,表现为协同作用;MEM+AK、AK+LEV和PB+IMP联合对CRECL60的FICI值均为0.5,表现为协同作用。时间杀伤实验中任何组合对CRECL42未见协同作用;TIG(0.5MIC和1MIC)+MEM/IMP(1MIC)和TIG(2MIC)+IMP(0.5MIC和1MIC)组合对CRECL60表现为协同作用;TIG(0.5MIC和1MIC)+IMP(0.5MIC和1MIC)组合对CRKP294表现出协同作用;TIG(0.5MIC、1MIC和2MIC)+MEM/IMP(0.5MIC)组合对CRECL352表现出拮抗作用。1MIC IMP在4-12h对所有菌株均表现为强于所有组合的杀菌及抑菌能力,TIG+1MIC IMP在24h对CRECL60(携带blaIMP-26)表现为强于其他组合的协同作用。4、1株CRKP为强生物膜形成,3株CRECL为弱生物膜形成。1株CRKP对于血清杀伤表现为抵抗现象,2株CRECL表现为对血清杀伤中介,1株CRECL对血清杀伤极度敏感。5、4株携带IMP金属酶的菌株中仅CRECL42菌株接合成功,质粒稳定性检测中Inc P质粒最稳定,传代50次,质粒未丢失,其次是Inc C和Inc HI2,最不稳定的是Inc U,接合子的质粒比原始菌的质粒更稳定。6、全基因组测序显示3株CRECL的MLST分型分别为ST520、ST528、ST25,1株CRKP为ST37;4株CRE的质粒类型分别为Inc C、Inc HI2、Inc U、Inc P;不同菌株携带blaIMP的质粒同时携带多个不同耐药基因和毒力因子;blaIMP-4和blaIMP-26均在1类整合子上,blaIMP-4的周围环境为acc(6’)-lb-qac G2-ltr A-bla IMP-4-intl1和acc(6’)-lb-qac G2-blaIMP-4-intl1,blaIMP-26的周围环境为IS6100-sul1-qac E-ltr A-bla IMP-26-intl1-drf A19;3株菌检出“F”型T4SS,组成蛋白包括tra C、tra D、tra I、tra G、tra A等,1株菌检出“P”型T4SS,组成蛋白包括trb G、trb B、trb H、trb F等。7、接合子J42的接合基因tra D的相对表达量为CRECL42的1.08倍,而CRECL60和CRKP294的接合基因tra D相对表达量为CRECL42的0.31倍。结论1、当IMP的体外MIC≤4μg/m L时,棋盘滴定法和时间杀伤试验的体外抗菌活性表明对携带blaIMP-4单独使用IMP在8-12h抑菌活性最好,对携带blaIMP-26联合使用TIG+1MIC IMP在24h杀菌效果最好,建议临床针对携带blaIMP-4且IMP的最低抑菌浓度≤4μg/m L的肠杆菌临床治疗可以使用IMP(短效),针对携带blaIMP-26的肠杆菌临床治疗可以联合使用TIG+1MIC IMP(长效)。2、携带IMP-4和IMP-26碳青霉烯类耐药基因对毒力的影响较小。3、本研究中blaIMP-4和blaIMP-26均位于不同质粒的1类整合子上,其中两株阴沟肠杆菌blaIMP-4的周围环境相同,均为acc(6’)-lb-qac G2-blaIMP-4-intl1,并且其中一株Inc C型质粒接合成功,说明Inc C质粒可导致耐药质粒的水平传播,在blaIMP-4传播过程中起到了重要作用。4、携带blaIMP-4和blaIMP-26的不同质粒稳定性不一样,Inc P质粒最稳定,其次是Inc C和Inc HI2,最不稳定的是Inc U,接合子的质粒比原始菌的质粒更稳定,质粒的稳定性与接合成功有关。5、携带blaIMP-4的质粒中,编码T4SS的vir D的表达与否以及tra D基因的表达量的高低可能影响细菌间的接合能力,从而促进耐药质粒的传播。