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【目的】构建一种多基因真核表达载体，实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因的表达产物在同一细胞不同细胞器中的定位，为肿瘤和自身免疫性疾病的多基因联合治疗提供实验依据和方法。【方法】以口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）和马鼻炎A病毒（Equine rhinitis A virus, ERAV）中2A肽为基础，设计合成一段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列（5-ATG-Nhe I-Kpn I-F2A-Xho I-E2A-EcoRI-TAA-BamH I-3），分别含起始密码子ATG、限制性内切酶Nhe I、Kpn I、F2A肽，Xho I、E2A肽、EcoR I、终止密码子TAA以及BamH I位点，整个序列长度为168bp，合成序列用Nhe I和BamH I酶切后插入pcDNA3.1(-) Myc/His B真核表达载体中，即构建成功pcDNA3.12A。然后将带有膜定位的红色荧光蛋白（ERFP）、核定位的绿色荧光蛋白（EGFP）和胞浆定位的黄色荧光蛋白（EYFP）顺序插入2A肽之间的位点中，构建多基因真核表达载体pcDNA3.1ERFP-EGFP-EYFP。用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞。24h和48h后，利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达及其亚细胞定位。【结果】转染24小时后用流式细胞仪检测，可同时检测到EGFP和ERFP的表达，EGFP平均表达率为68.85%,ERFP平均表达率为62.59%，两种荧光蛋白的表达率比较接近，统计学无明显差异；荧光显微镜下可同时观察到绿色荧光和红色荧光；共聚焦显微镜下观察到在单一细胞上同时显示三种荧光， ERFP定位在细胞膜上，EGFP主要定位在细胞核中，而EYFP主要定位于细胞浆中。【结论】通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因。此外，在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器，实现同一细胞中不同的亚细胞定位，并且荧光蛋白跨膜定位较胞浆和核定位需要更长的时间来完成，为深入研究基因治疗的多基因联合表达以及不同的亚细胞定位需求奠定了实验基础。