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目的:皮肤恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是来源于黑素细胞的恶性肿瘤,发病年龄多在30岁以后,它的发生可能与种族遗传、创伤刺激、病毒感染、日光照射及免疫因素有关。黑色素瘤恶性程度极高,肿瘤早期阶段即可发生血液及淋巴液转移,一旦发生转移,治愈的可能性大大降低。骨骼和肝脏是转移性黑色素瘤扩散的首选器官,这对生活质量、治疗成功率和总生存率影响极大。如何提高患者的治愈率、延长患者的生存期仍是黑色素瘤的研究焦点。T-钙粘蛋白(T-cadherin)又称为H-cadherin、Cadherin 13(CDH13),它的分子结构与生物功能不同于其他钙粘蛋白成员。目前认为,T-钙粘蛋白主要通过它的信号特性影响细胞的生物学行为。随着对T-钙粘蛋白与肿瘤关系研究的深入,T-钙粘蛋白对肿瘤的作用不断被了解。近年来,大量研究表明T-钙粘蛋白与恶性肿瘤的增殖、浸润和转移等生物学行为密切相关。T-钙粘蛋白在恶性肿瘤中的表达通常是下调的,如肺癌、卵巢癌、膀胱癌、宫颈癌和前列腺癌,但在原发性肝细胞癌和骨肉瘤中表达上调。基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一个序列和结构高度同源的蛋白酶系统,在基膜和细胞外基质成分的降解过程中起重要作用。MMPs主要由血管内皮细胞和肿瘤细胞合成,活性中心含有锌离子。MMPs以酶原形式分泌到细胞外基质,被基质中的其他MMPs或胞外纤溶系统激活。MMPs蛋白家族在调节肿瘤新生血管的生成、促进肿瘤细胞侵袭和迁移的过程中发挥重要作用。本课题组以往的研究已经证实,T-cadherin基因转染黑素瘤细胞B16F10后,细胞的侵袭和迁移能力明显降低,但具体作用途径尚未研究。本研究以小鼠黑素瘤细胞B16F10为研究对象,用脂质体转染法将T-cadherin基因转入B16F10细胞,探讨T-钙粘蛋白对B16F10细胞中基质金属蛋白酶MMP2、MMP9表达的影响。方法:1.实验对象:黑素瘤B16F10细胞系。2.实验分组及稳定转染:本实验分为3组,分别为未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin载体质粒组。将B16F10细胞种于6孔板,待细胞融合度约90%时,用脂质体Lipotectamine2000、Opti-MEM及空质粒、T-cadherin载体质粒进行转染,用G418进行筛选,采用有限稀释法获取稳定转染细胞系。3.实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)实验,提取未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin载体质粒组细胞总RNA,验证转染基因的表达情况,检测MMP2、MMP9基因表达的变化。4.蛋白免疫印记技术(Western blot)实验,提取未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin载体质粒组细胞总蛋白,验证转染基因的蛋白表达情况,检测MMP2、MMP9蛋白表达的变化。5.采用统计软件SPSS19.0进行数据处理,资料用x±s描述,并采用单因素方差分析进行统计分析,组间两两比较采用SNK-q检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.T-cadherin基因转染B16F10细胞结果的验证qRT-PCR、Westeren-blot法分别检测未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin组中转染基因及其蛋白的表达情况。1.1 qRT-PCR法检测未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin组中,转染基因表达情况,结果分别为1.00±0.00、1.01±0.11、5.13±0.18,组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。1.2 Westeren-blot法检测未转染组、转染空质粒组、转染T-cadher-in组中,转染基因的蛋白表达水平分别为:0.10±0.02、0.85±0.11、0.87±0.06,组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。2.qRT-PCR法检测未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin组中MMP2、MMP9的基因表达情况。2.1 qRT-PCR法检测未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin组中MMP2的基因表达水平。结果分别为1.00±0.00、0.99±0.03、0.47±0.02,转染T-cadherin组MMP2的mRNA表达水平较未转染组、转染空质粒组明显减少,组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。2.2 qRT-PCR法检测未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin组中MMP9的基因表达水平。结果分别为1.00±0.00、1.01±0.07、0.99±0.03,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.Westeren-blot法检测未转染组、转染空质粒组、转染T-cadherin组中MMP2、MMP9的蛋白表达情况。3.1 Westeren-blot法检测未转染组、转染空质粒、转染T-cadherin组中MMP2的蛋白表达水平。结果分别为:0.52±0.07、0.48±0.05、0.27±0.05,转染T-cadherin组的MMP2蛋白表达水平较未转染组、转染空质粒组明显减少,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.2 Westeren-blot法检测未转染组、转染空质粒、转染T-cadherin三组中,MMP9的蛋白表达水平分别为:0.37±0.10、0.40±0.02、0.41±0.10,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:T-cadherin基因转染恶性黑素瘤细胞后,可下调MMP2的表达,可能对MMP9的表达没有影响。