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昆虫成为地球上最为繁盛的动物类群，得益于其对自然的适应能力，也包括与之密切相关的灵活多变的生活史策略，如滞育、拟态和警戒色及远距离迁飞等都有利于自身的存活和种群的扩张。泌丝营茧是完全变态昆虫保护蛹向成虫转化的有效策略之一，包括鞘翅目、鳞翅目、膜翅目和脉翅目等在内的许多昆虫都能够吐丝作茧。茧通常是老熟幼虫用自身分泌的丝或用丝附着周围的物质(如土壤和木屑)构建而成。茧不仅是昆虫蛹化的场所，还可以为蛹抵抗机械损伤、躲避天敌和寄生虫等不利因素，保护其安全地渡过变态发育阶段。
对于营封闭茧的昆虫，蛹成功变态为蛾后，必须破茧而出才能完成继代使命。各类昆虫营茧的方式多种多样，破茧而出的方法也不尽相同。据研究报道，营封闭茧的家蚕和柞蚕属的昆虫在破茧而出时，其成虫能够分泌碱性的吐出液浸润茧层，而后吐出液中的溶茧酶降解茧层的丝胶而使茧变得松软，蚕蛾得以利用其胸足拨开松散的茧丝从茧内爬出。然而，在蚕蛾的吐出液中除溶茧酶外还含有28种蛋白，其中不乏酶蛋白，是否有其它蛋白参与了溶茧的过程尚不清楚，且许多科的昆虫都能够泌丝结茧，溶茧酶是否也在其它营封闭茧类昆虫破茧而出的过程中发挥作用尚未有研究报道。
本研究中，我们对溶茧酶基因的起源、进化、在物种中的分布范围及其在进化过程中受到的选择作用进行了分析，并以家蚕为营封闭茧的模式昆虫，利用基因组编辑技术探究了溶茧酶的生物学功能。最后，我们探讨了以溶茧酶为靶基因创制“不破茧”的家蚕新型育种素材的应用价值。本研究主要取得如下结果：
1.溶茧酶为鳞翅目昆虫特异表达基因
为调查溶茧酶在物种中的分布范围、探究该基因的起源，我们进行了进化分析。以家蚕溶茧酶的蛋白序列为查询序列，在NR数据库及昆虫和鳞翅目数据库中共检索到295条序列一致性大于40%的同源蛋白。系统发生分析显示这些同源序列中有70个蛋白与家蚕的溶茧酶聚为一支，通过对部分基因的重预测及进一步的结构域分析，最终将72个同源蛋白鉴定为溶茧酶的直系同源物。这些同源物均含有蛋白酶前体的剪切位点、三联体催化活性位点(His-Asp-Ser)及形成3个二硫键的关键半胱氨酸残基。进一步调查发现所有的溶茧酶仅来自于蛾类和蝶类，说明溶茧酶基因是鳞翅目昆虫特异表达基因。同时，染色体微区段的共线性分析结果也证实溶茧酶为鳞翅目特有基因，且其与邻近基因在染色体上的分布位置在鳞翅目昆虫间较为保守。
2.溶茧酶基因在进化过程中受到纯化选择压力的影响
为了解溶茧酶基因的分子进化基础，我们利用EasycodeML软件中的枝模型检测了溶茧酶基因在进化过程中受到的选择压力情况。在假设系统发育树中所有支系的ω值相等的情况下，单比率模型检测的结果表明进化树中各支系的溶茧酶基因主要受到纯化选择的作用(ω=0.16308)；当假设溶茧酶基因在营开口茧(ω1)和营封闭茧(ω2)的鳞翅目昆虫中受到的选择压力不同时，双比率模型检测的结果与单比例模型检测的结果一致，即溶茧酶基因受到纯化选择作用(ω0=0.16603，P=0.06688)，但在营封闭茧的昆虫中受到更加强烈的纯化选择作用(ω1=0.13840，ω2=0.04881)。选择压力分析的结果暗示溶茧酶基因可能在营封闭茧的昆虫中具有更加保守的功能位点，说明其功能的保守性。
由物种进化树可以得知尖蛾科昆虫Hyposmocomakahamanoa(Hyposmocoma， Cosmopterigidae)是鳞翅目昆虫中进化较早的物种。该类昆虫属于水陆两栖类昆虫，并不存在营茧行为，但其也有溶茧酶基因。结合鳞翅目各物种的分化时间及营茧行为，我们认为溶茧酶基因在鳞翅目营茧类昆虫出现前就已被其祖先获得，这使得成虫羽化后可破茧而出。此外，鳞翅目中多个科的昆虫都能够泌丝结茧，这可能是平行进化的结果。
3.CRISPR/Cas9双元转基因品系介导的家蚕溶茧酶基因的敲除
为了调查溶茧酶基因的表达与家蚕生长发育之间的关系并预判基因敲除后的表型，我们通过qRT-PCR调查了溶茧酶基因(BmCoc)在家蚕整个生活周期中的表达情况。表达分析的结果显示，家蚕溶茧酶基因在蛹5天时开始表达，随后持续高表达，至蛹8天时达到最高峰，随后迅速下降，在新羽化的蚕蛾中已检测不到该基因的表达。溶茧酶基因特异在蛹中后期表达的模式暗示其可能在蛾的羽化过程中或羽化后发挥某种重要作用。
为了探究溶茧酶是否为蛾吐出液中辅助成虫破茧而出的唯一因子，我们以家蚕为模式，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除溶茧酶基因。我们分别构建了表达Cas9和靶向溶茧酶基因的gRNA的双元转基因品系。通过双元转基因品系间的杂交并结合荧光筛选及分子检测，最终获得了溶茧酶基因敲除的纯合品系(BmCoc???)。我们调查了溶茧酶基因在纯合突变品系BmCoc???中的mRNA和蛋白质表达水平。定量检测的结果表明溶茧酶的mRNA表达水平显著低于在野生型个体中的表达水平。同时，对收集到的纯合突变体和野生型个体的蛾吐出液进行SDS-PAGE分析，结果显示在纯合突变体中已基本检测不到溶茧酶(预测的蛋白质分子量大小为23.7kDa)。以上结果说明我们获得了溶茧酶基因已被完全破坏的纯合突变体。
4.溶茧酶是家蚕蛾破茧而出的必需因子
在饲养的过程中，我们观察到溶茧酶基因敲除的纯合突变体均能够正常地生长发育、泌丝结茧。化蛹11天后可见所有的野生型家蚕均已破茧而出，溶茧酶基因敲除的嵌合体及杂合体也都能够从茧中逃逸，然而始终未见有纯合突变体破茧而出。小心用刀片削开茧层，可见蛹已成功变态为蛾，说明敲除溶茧酶基因不影响蚕蛾的羽化。尽管在纯合突变的蚕蛾吐出液中可检测到其它蛋白，但溶茧酶基因敲除的纯合突变体仍不能破茧而出，说明溶茧酶是蚕蛾破茧而出的必需因子。
5.家蚕“不破茧”素材的实用性评估
溶茧酶基因敲除的纯合突变体羽化后因不能破茧而出而在茧内自然地死亡，未见蛾体有变软和霉变的现象，且自然条件下存放长达6个月后蚕茧仍颜色亮丽、完好如初。这些表型符合我们对“免烘茧”品系的预期。为评价“不破茧”品系(BmCoc???)的实用性前景，通过杂交及6代的回交选育，我们成功将溶茧酶基因的突变位点导入到现行实用品种872中，并通过BC6个体间的自交筛选获得了纯合突变体，即“不破茧”转育品系872。随后，我们对“不破茧”基础品系Dazao和转育品系872的纯合突变体进行了全面细致的检测。首先我们从产卵数和孵化率两方面对纯合突变体进行了调查，结果显示两个性状在纯合突变体与野生型个体之间没有差异，说明敲除溶茧酶基因不影响家蚕的生殖能力。其次，我们从五龄的龄期经过、全龄的龄期经过、病蚕率(4-5龄)、结茧率和健蛹率五个方面对纯合突变体的健康性进行了调查，结果显示，与野生型个体相比5个指标在纯合突变个体中无明显变化，说明敲除溶茧酶基因不影响家蚕的正常生长发育。最后，我们从全茧重、茧层重和茧层率3个方面对茧质性状进行了调查，结果显示，这3个关键茧质性状在纯合突变与野生型之间(雌雄分别比较)均没有明显差异，说明敲除溶茧酶基因不影响家蚕的茧质性状。
综上所述，溶茧酶基因为鳞翅目昆虫特异表达基因，并且该基因在进化过程中主要受到纯化选择的作用。我们的研究首次通过实验证实了溶茧酶基因是营封闭茧的鳞翅目昆虫破茧而出的必需因子。溶茧酶基因敲除的纯合突变品系作为一种新型的免烘茧品系经过培育和进一步地评估及改良利用，将有望为蚕丝产业带来重大革新。此外，本研究也为鳞翅目害虫防治提供了新的策略和靶标，通过失活酶的水解作用或利用基因驱动的手段都可以降低害虫的群体数量。
对于营封闭茧的昆虫，蛹成功变态为蛾后，必须破茧而出才能完成继代使命。各类昆虫营茧的方式多种多样，破茧而出的方法也不尽相同。据研究报道，营封闭茧的家蚕和柞蚕属的昆虫在破茧而出时，其成虫能够分泌碱性的吐出液浸润茧层，而后吐出液中的溶茧酶降解茧层的丝胶而使茧变得松软，蚕蛾得以利用其胸足拨开松散的茧丝从茧内爬出。然而，在蚕蛾的吐出液中除溶茧酶外还含有28种蛋白，其中不乏酶蛋白，是否有其它蛋白参与了溶茧的过程尚不清楚，且许多科的昆虫都能够泌丝结茧，溶茧酶是否也在其它营封闭茧类昆虫破茧而出的过程中发挥作用尚未有研究报道。
本研究中，我们对溶茧酶基因的起源、进化、在物种中的分布范围及其在进化过程中受到的选择作用进行了分析，并以家蚕为营封闭茧的模式昆虫，利用基因组编辑技术探究了溶茧酶的生物学功能。最后，我们探讨了以溶茧酶为靶基因创制“不破茧”的家蚕新型育种素材的应用价值。本研究主要取得如下结果：
1.溶茧酶为鳞翅目昆虫特异表达基因
为调查溶茧酶在物种中的分布范围、探究该基因的起源，我们进行了进化分析。以家蚕溶茧酶的蛋白序列为查询序列，在NR数据库及昆虫和鳞翅目数据库中共检索到295条序列一致性大于40%的同源蛋白。系统发生分析显示这些同源序列中有70个蛋白与家蚕的溶茧酶聚为一支，通过对部分基因的重预测及进一步的结构域分析，最终将72个同源蛋白鉴定为溶茧酶的直系同源物。这些同源物均含有蛋白酶前体的剪切位点、三联体催化活性位点(His-Asp-Ser)及形成3个二硫键的关键半胱氨酸残基。进一步调查发现所有的溶茧酶仅来自于蛾类和蝶类，说明溶茧酶基因是鳞翅目昆虫特异表达基因。同时，染色体微区段的共线性分析结果也证实溶茧酶为鳞翅目特有基因，且其与邻近基因在染色体上的分布位置在鳞翅目昆虫间较为保守。
2.溶茧酶基因在进化过程中受到纯化选择压力的影响
为了解溶茧酶基因的分子进化基础，我们利用EasycodeML软件中的枝模型检测了溶茧酶基因在进化过程中受到的选择压力情况。在假设系统发育树中所有支系的ω值相等的情况下，单比率模型检测的结果表明进化树中各支系的溶茧酶基因主要受到纯化选择的作用(ω=0.16308)；当假设溶茧酶基因在营开口茧(ω1)和营封闭茧(ω2)的鳞翅目昆虫中受到的选择压力不同时，双比率模型检测的结果与单比例模型检测的结果一致，即溶茧酶基因受到纯化选择作用(ω0=0.16603，P=0.06688)，但在营封闭茧的昆虫中受到更加强烈的纯化选择作用(ω1=0.13840，ω2=0.04881)。选择压力分析的结果暗示溶茧酶基因可能在营封闭茧的昆虫中具有更加保守的功能位点，说明其功能的保守性。
由物种进化树可以得知尖蛾科昆虫Hyposmocomakahamanoa(Hyposmocoma， Cosmopterigidae)是鳞翅目昆虫中进化较早的物种。该类昆虫属于水陆两栖类昆虫，并不存在营茧行为，但其也有溶茧酶基因。结合鳞翅目各物种的分化时间及营茧行为，我们认为溶茧酶基因在鳞翅目营茧类昆虫出现前就已被其祖先获得，这使得成虫羽化后可破茧而出。此外，鳞翅目中多个科的昆虫都能够泌丝结茧，这可能是平行进化的结果。
3.CRISPR/Cas9双元转基因品系介导的家蚕溶茧酶基因的敲除
为了调查溶茧酶基因的表达与家蚕生长发育之间的关系并预判基因敲除后的表型，我们通过qRT-PCR调查了溶茧酶基因(BmCoc)在家蚕整个生活周期中的表达情况。表达分析的结果显示，家蚕溶茧酶基因在蛹5天时开始表达，随后持续高表达，至蛹8天时达到最高峰，随后迅速下降，在新羽化的蚕蛾中已检测不到该基因的表达。溶茧酶基因特异在蛹中后期表达的模式暗示其可能在蛾的羽化过程中或羽化后发挥某种重要作用。
为了探究溶茧酶是否为蛾吐出液中辅助成虫破茧而出的唯一因子，我们以家蚕为模式，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除溶茧酶基因。我们分别构建了表达Cas9和靶向溶茧酶基因的gRNA的双元转基因品系。通过双元转基因品系间的杂交并结合荧光筛选及分子检测，最终获得了溶茧酶基因敲除的纯合品系(BmCoc???)。我们调查了溶茧酶基因在纯合突变品系BmCoc???中的mRNA和蛋白质表达水平。定量检测的结果表明溶茧酶的mRNA表达水平显著低于在野生型个体中的表达水平。同时，对收集到的纯合突变体和野生型个体的蛾吐出液进行SDS-PAGE分析，结果显示在纯合突变体中已基本检测不到溶茧酶(预测的蛋白质分子量大小为23.7kDa)。以上结果说明我们获得了溶茧酶基因已被完全破坏的纯合突变体。
4.溶茧酶是家蚕蛾破茧而出的必需因子
在饲养的过程中，我们观察到溶茧酶基因敲除的纯合突变体均能够正常地生长发育、泌丝结茧。化蛹11天后可见所有的野生型家蚕均已破茧而出，溶茧酶基因敲除的嵌合体及杂合体也都能够从茧中逃逸，然而始终未见有纯合突变体破茧而出。小心用刀片削开茧层，可见蛹已成功变态为蛾，说明敲除溶茧酶基因不影响蚕蛾的羽化。尽管在纯合突变的蚕蛾吐出液中可检测到其它蛋白，但溶茧酶基因敲除的纯合突变体仍不能破茧而出，说明溶茧酶是蚕蛾破茧而出的必需因子。
5.家蚕“不破茧”素材的实用性评估
溶茧酶基因敲除的纯合突变体羽化后因不能破茧而出而在茧内自然地死亡，未见蛾体有变软和霉变的现象，且自然条件下存放长达6个月后蚕茧仍颜色亮丽、完好如初。这些表型符合我们对“免烘茧”品系的预期。为评价“不破茧”品系(BmCoc???)的实用性前景，通过杂交及6代的回交选育，我们成功将溶茧酶基因的突变位点导入到现行实用品种872中，并通过BC6个体间的自交筛选获得了纯合突变体，即“不破茧”转育品系872。随后，我们对“不破茧”基础品系Dazao和转育品系872的纯合突变体进行了全面细致的检测。首先我们从产卵数和孵化率两方面对纯合突变体进行了调查，结果显示两个性状在纯合突变体与野生型个体之间没有差异，说明敲除溶茧酶基因不影响家蚕的生殖能力。其次，我们从五龄的龄期经过、全龄的龄期经过、病蚕率(4-5龄)、结茧率和健蛹率五个方面对纯合突变体的健康性进行了调查，结果显示，与野生型个体相比5个指标在纯合突变个体中无明显变化，说明敲除溶茧酶基因不影响家蚕的正常生长发育。最后，我们从全茧重、茧层重和茧层率3个方面对茧质性状进行了调查，结果显示，这3个关键茧质性状在纯合突变与野生型之间(雌雄分别比较)均没有明显差异，说明敲除溶茧酶基因不影响家蚕的茧质性状。
综上所述，溶茧酶基因为鳞翅目昆虫特异表达基因，并且该基因在进化过程中主要受到纯化选择的作用。我们的研究首次通过实验证实了溶茧酶基因是营封闭茧的鳞翅目昆虫破茧而出的必需因子。溶茧酶基因敲除的纯合突变品系作为一种新型的免烘茧品系经过培育和进一步地评估及改良利用，将有望为蚕丝产业带来重大革新。此外，本研究也为鳞翅目害虫防治提供了新的策略和靶标，通过失活酶的水解作用或利用基因驱动的手段都可以降低害虫的群体数量。