研究背景我国糖尿病及其并发症的发病率正逐年升高,危害逐渐扩大。胰岛β细胞功能及β细胞团体积的进行性损伤是1型及2型糖尿病的共同特征。由于胰岛β细胞的活跃的分泌功能,使得它长期暴露于体内各种应激损伤下,如糖毒性、脂毒性及氧化应激。糖尿病时,血液循环的高糖状态会诱发氧化应激,而慢性氧化应激能够引起胰岛β细胞的损伤及死亡。与体内其他细胞相比,β细胞的抗氧化酶,如过氧化氢酶及谷胱甘肽,含量非常低,这使得β细胞对氧化应激损伤更加敏感。越来越多的证据显示nrf2作为体内最大的抗氧化应激体系,能够诱导细胞保护性的Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白的生成,因此提示nrf2有可能通过抑制氧化应激及与体内其他调控能量代谢的转录因子及受体相互作用来减缓或阻止糖尿病的发生。Dihydro-CDDO-Trifluoroethyl Amide (dh404)是三萜系化合物的衍生物,它能够修饰Keapl第151位的半胱氨酸,稳定nrf2蛋白,促进nrf2的核转位,从而激活nrf2的转录功能。Nrf2激活的幅度因细胞所处状态相关,瘦素缺陷的ob/ob、鼠体内诱导nrf2基因转录后表现出胰岛素抵抗和脂肪合成功能受损。然而,给瘦素受体缺陷的db/db小鼠口服nrf2诱导剂CDDO-Im后,nrf2基因表达被激活后能够明显增大β细胞团体积预防小鼠糖尿病的发病。虽然这些现象的具体机制仍未明确,但近来β细胞特异性的nrf2获得/缺失实验证实了nrf2能够保护胰岛β细胞的氧化应激损伤。然而,nrf2修复β细胞团体积的其他潜在的独立机制尚需证实。巨自噬(通常所说的自噬)降解胞浆成分的能力是一种高度保守的细胞机制,不仅在胰岛正常结构的维持中发挥了重要的作用而且对于糖尿病状态下β细胞对胰岛素抵抗和氧化应激的适应性反应机制也是必不可少的。自噬开始有自噬体的形成,这是一种将胞浆内容物囊括其中的双模结构,继而与溶酶体融合形成自噬溶酶体消化分解内容物。自噬和泛素蛋白酶系统(UPS)被认为是细胞内异常蛋白产物的最主要的降解/清除途径,UPS主要通过泛素化途径清除可溶性错误折叠或受损的蛋白,而自噬主要清除可溶性稍差或非可溶性毒性泛素化蛋白聚合物。重要的是,自噬清除胰岛的毒性泛素化蛋白似乎是保护β细胞免受氧化应激损伤所致糖尿病的一个关键机制,越来越多的证据显示nrf2介导的自噬清除泛素化蛋白聚集作用仅次于抑制活性氧簇的形成过程。既然活性氧簇是自噬激活的重要诱导介质,而nrf2是各种细胞中活性氧簇形成的内源性抑制因子,因此我们有理由相信nrf2能够通过一种独立于活性氧簇形成的机制易化自噬清除功能。然而这种假想尚待进一步探索,糖尿病状态下胰岛nrf2激活后是否能够促进自噬清除来保护β细胞免受氧化应激诱导的细胞损伤尚未明确。研究目的本研究旨在研究体外培养的胰岛β细胞及体外分离的大鼠胰岛中nrf2介导的抗氧化应激作用及通过诱导自噬对泛素化蛋白聚集的清除保护胰岛存活及功能的机制,同时通过对糖尿病小鼠的胰岛移植后进行nrf2激动剂干预来进一步证实nrf2对胰岛的保护作用,从而为糖尿病提供新的治疗思路与策略。研究方法第一部分Nrf2激动剂对体外分离的大鼠胰岛氧化应激损伤的保护作用及机制1.通过对新发糖尿病患者及STZ诱导的新发糖尿病小鼠胰岛进行nrf2的免疫荧光染色及RT-PCR研究,确定新发糖尿病状态下胰岛β细胞nrf2的表达情况。2.进而通过H202刺激体外分离的大鼠胰岛作为氧化应激模型进行nrf2激动剂dh404预处理干预,通过检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能(GSIS)、LDH细胞毒试剂盒检测胰岛的死亡率和TUNEL染色检测胰岛β细胞凋亡,研究dh404对氧化应激诱导的大鼠胰岛的死亡及功能的保护作用。3.进一步进行机制研究,通过对体外分离的大鼠胰岛的nrf2, NQ01、4HNE、LC3、p62及泛素化蛋白的免疫组化及Western检测,明确nrf2激动剂dh404对H202诱导的大鼠胰岛的氧化应激状态、nrf2通路、自噬活性及泛素化蛋白清除的作用及机制。第二部分Nrf2激动剂通过激活自噬清除氧化应激诱导的泛素化蛋白聚集保护胰岛β细胞功能的机制1.H202处理的INS-1细胞作为氧化应激模型进行dh404干预,通过nrf2RNAi干扰nrf2的表达,进行LDH细胞毒检测,确定dh404对氧化应激诱导的β细胞存活率的影响。2.进而Western blot检测泛素化蛋白的蓄积及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、P62的蛋白表达水平的变化情况,来验证dh404对促进胰岛β细胞中自噬对泛素化蛋白聚合物的清除是否是通过激活nrf2通路来完成的。3.本文采用了自噬体与溶酶体融合过程的抑制剂氯喹(CQ)抑制自噬活性,nrf2RNAi进行nrf2敲除,通过提取INS-1细胞的可溶性与非可溶性蛋白成分进行Western blot检测泛素化蛋白聚合物的蓄积和LC3-Ⅱ、p62蛋白水平的变化情况,来证实β细胞内nrf2和dh404诱导的自噬对泛素化蛋白聚合物的清除之间存在直接的联系。第三部Nrf2激动剂对糖尿病小鼠胰岛移植后效果的作用及机制研究1.对体外培养的胰岛微血管内皮细胞MS-1细胞进行dh404预处理及高糖刺激48h,进行LDH细胞毒检测细胞死亡率、检测氧化应激及炎性因子水平及Western blot和RT-PCR法检测nrf2、NQ01AT1VEGF-A及eNOS的表达水平,来验证dh404激活nrf2后对胰岛β细胞的氧化应激状态及炎症反应的影响及对胰岛微血管内皮细胞功能的作用。2.对体外培养的小鼠胰岛进行dh404预处理及高糖刺激48h, eVOS观察胰岛的向心性坏死面积、GSIS功能及Western blot和RT-PCR法检测nrf2、NQ01AT1、 VEGF-A的表达水平,来明确dh404对高糖诱导的胰岛微循环内皮细胞功能的影响及胰岛死亡和损伤的作用。3.进行体内研究,采用STZ诱导的糖尿病小鼠作为胰岛移植的受体模型进行门静脉胰岛移植并进行dh404(lOmg/kg体重)灌胃15天,在第15、30天行腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)观察胰岛移植及dh404干预对血糖谱及胰岛素分泌功能的影响,同时检测血清的炎性介质水平验证dh404对小鼠胰岛移植后炎性反应的影响。研究结果第一部分Nrf2激动剂对体外分离的大鼠胰岛氧化应激损伤的保护作用及机制1.激光共聚焦显微镜观察新发病糖尿病患者及STZ诱导的新发糖尿病小鼠的胰腺标本的免疫荧光结果,显示糖尿病组胰岛体积变小,结构紊乱、胰岛素着色细胞减少,同时nrf2表达增高,而血糖正常的胰岛,胰岛体积大,胰岛整体着色深,nrf2表达较糖尿病患者少,且与周围组织细胞相比荧光强度低,提示nrf2在糖尿病发病早期是激活的。同时RT-PCR法检测STZ诱导的新发糖尿病小鼠胰岛的nrf2及NQ01的基因表达进行检测发现新发糖尿病小鼠胰岛的nrf2及NQ01的mRNA表达水平上调。2.H2O2刺激体外分离的大鼠胰岛作为氧化应激模型进行nrf2激动剂dh404预处理干预后,大鼠胰岛的GSIS得到改善,胰岛β细胞的死亡率降低。3.免疫组化及Western检测结果显示,dh404干预大鼠胰岛后与H2O2组相比,nrf2及NQ01表达水平显著升高,4HNE表达降低,LC3、p62及泛素化蛋白聚合物的表达降低,表明nrf2激动剂dh404抑制了H2O2诱导的大鼠胰岛的氧化应激状态,激活了nrf2通路,促进了自噬对泛素化蛋白清除的清除。第二部分Nrf2激动剂通过激活自噬清除氧化应激诱导的泛素化蛋白聚集保护胰岛β细胞功能的机制1.LDH细胞毒检测结果显示,对H2O2处理的INS-1细胞进行dh404干预后,β细胞存活率较单纯H2O2处理组显著升高,而这种保护作用在nrf2RNAi干扰后被显著抑制,证实了dh404对氧化应激诱导的β细胞存活率的影响是通过nrf2通路来完成的。2. Western blot检测结果显示,nrf2RNAi干扰后,dh404诱导的自噬对泛素化蛋白的蓄积的清除作用显著降低,提示dh404对促进胰岛β细胞中自噬对泛素化蛋白聚合物的清除是通过激活nrf2通路来完成的。3. Western blot检测结果显示,在dh404和H2O2处理的对照组细胞中,CQ处理后引起了非可溶性蛋白成分中泛素化蛋白聚合物的明显蓄积和LC3-Ⅱ及p62蛋白水平的显著上调,然而,这种作用在nrf2敲除后被显著抑制。证实nrf2在dh404诱导的自噬对β细胞的泛素化蛋白聚合物的清除过程中是必不可少的。第三部Nrf2激动剂对糖尿病小鼠胰岛移植后效果的作用及机制研究1.Dh404预处理高糖诱导的MS-1细胞48h后,细胞的死亡率、氧化应激状态及炎性因子水平得到了显著改善。Western blot和RT-PCR结果显示nrf2和NQ01表达水平显著升高、AT1表达水平降低、VEGF-A及eNOS的表达水平上调。提示dh404激活nrf2后抑制了胰岛微循环内皮细胞的氧化应激及炎症反应,同时改善了内皮功能。2.对体外培养的小鼠胰岛进行dh404预处理及高糖刺激48h,胰岛的向心性坏死面积及GSIS功能得到了显著改善,Western blot和RT-PCR结果显示nrf2和NQ01表达水平升高、AT1表达水平降低、VEGF-A的表达水平上调。证实dh404对高糖诱导的胰岛微循环内皮细胞功能具有保护作用。3.体内研究结果显示,dh404干预胰岛移植后的糖尿病小鼠后,IPGTT结果显示与单纯胰岛移植组相比,dh404干预组小鼠的血糖谱及胰岛素分泌功能得到了显著改善同时炎症反应也得到了明显抑制。研究结论在我们的研究中,首次揭示了新发病的糖尿病患者和小鼠胰岛的nrf2表达是上调的,提示nrf2与人类糖尿病发病机制的临床关联。高糖毒性诱导氧化应激产生后,所生成的ROS及毒性蛋白产物损伤了胰岛β细胞的功能及加速了细胞死亡,nrf2作为体内最大的抗氧化应激系统被激活,清除ROS抑制氧化应激反应的同时还能够阻止毒性蛋白对β细胞的损伤,保护了β细胞的分泌功能并降低了细胞死亡率,这是胰岛在氧化应激状态下的一种代偿机制,然而随着氧化应激状态的持续存在这种代偿机制很快就会失代偿,nrf2对氧化应激的损伤的保护作用最终会不足以完全保持β细胞的功能完整,因此我们需要采用药物来进一步加强nrf2对β细胞的保护作用,事实上,药物激活nrf2能够抑制氧化应激状态下的β细胞死亡及损伤。从机制上来说,我们的研究显示dh404不仅能够激活胰岛的nrf2通路直接抑制氧化应激,而且还通过一种独立的抗氧化机制激活nrf2介导的泛素化蛋白聚合物的自噬清除过程。