异基因造血干细胞移植（HSCT）是治疗恶性和非恶性造血功能障碍重要的方法。遗憾的是，移植相关并发症限制其在临床上应用，如移植物抗宿主病（GVHD）。当前移植术后免疫抑制药方案还不能解决移植相关并发症。因此，术后并发GVHD仍然骨髓移植主要的发病率和死亡率。急性GVHD发生的病理生理被认为是一个多层次、多环节过程。首先是术前放疗或化疗造成宿主组织损伤从而发展和形成炎性环境。之后这些坏死的组织分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α），干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-1(IL-1)等炎性因子。然后这些炎症因子与来自受体和供体的抗原提呈细胞（APC）结合，引发了供者效应T细胞激活、增殖和分化。最后这些活化的供者T细胞通过Fas-Fas配体的相互作用、穿孔素颗粒酶B以及一些细胞因子，如TNF-α来攻击宿主组织，造成宿主各个脏器的损伤。急性GVHD主要侵犯皮肤、肝以及胃肠道，眼和口腔黏膜偶尔累及。调节性T（Treg）细胞是具有免疫调节的功能的一组不同Th1细胞和Th2细胞的T细胞亚群。广义说， CD4+Treg按具有免疫抑制能力可分为两种类型：天然型（nTreg）和诱导型（iTreg）或适应性调节细胞。正常体内由胸腺生成的CD4+CD25+调节性T细胞是T细胞具有免疫抑制特性的一个亚群，在外周血CD4+细胞中含量为5％-10％。Treg细胞可高表达IL-2受体的α链（CD25）和转录因子FoxP3。具有免疫抑制功能，参与多种免疫性疾病的发生的病理过程，成为近来免疫学领域的重要内容。在混合淋巴细胞反应中，患者外周血分离Treg已经证明可抑制同种异基因免疫应答。之前有人已经报道发现小鼠Treg细胞在同源抗原诱导下发挥其免疫耐受作用。因此，Treg细胞可能在预防GVHD的发生起作用。Taylor等研究发现，在小鼠同种异基因的骨髓移植模型中，当去除供体CD4+T细胞中的CD25+细胞，小鼠GVHD反应明显加重。之后用相同小鼠模型也证实CD4+CD25+T细胞可预防或抑制骨髓移植术后并发GVHD。在C57BL/6→BALB/c移植模型中，当供体共转染的CD4+CD25+效应细胞T细胞，供体Treg细胞可避免小鼠发生致命GVHD反应。当注射供体C57BL/6脾细胞分离出高浓度新鲜的CD4+CD25+T细胞，90%以上受体BALB/c小鼠可预防GVHD的发生。三个临床试验已报道用来评估调节性T细胞治疗GVHD的安全和有效性，结果表明此方法具有潜在安全性和可靠疗效。首先第一个临床试验涉及两个病人。第一个病人为移植术后2年并发慢性GVHD。当输入0.1×106/kg来自供者体外扩增Treg细胞，患者GVHD症状消退和成功避免免疫排斥反应。第二个病人尽管三次输入累积量3×106/kg来自供者体外扩增Treg细胞，但是疗效差，没能控制GVHD进展。最近，一个较大规模的1期临床试验已报道：23例有进展性的血液系统恶性肿瘤患者被纳入标准，并将两个单位的脐带血作为干细胞和Teffs细胞的来源。调节性T细胞是用第三方使用抗CD25免疫磁珠分离与受者HLA匹配的血液样本。将调节性T细胞输注受者体内，并在移植术后14天检测外周血Treg含量。观察输入Treg细胞患者的1年内生存情况，结果表明：没有发现剂量限制性毒性或不良事件增加，且与GVHD历年发病率和致死率比较，经输入Treg细胞治疗后，患者移植术后并发严重aGVHD显著减少。在第三个试验中，纳入28例患有高危并发GVHD因素的血液系统恶性肿瘤患者进行移植。在输入供者CD34+细胞和常规T细胞4天前，给予输入从同一供者的新鲜外周血经抗CD25免疫磁珠法分离高浓度Treg细胞（没有体外扩增）。移植术后患者不给辅助性免疫抑制方案。结果表明：患者表现出免疫重组加速，巨细胞病毒感染减少，并且肿瘤的复发率较低，只有2例（7％）患者发生aGVHD。这些令人鼓舞的早期经验支持的进一步研究和尝试使用调节性T细胞治疗和控制GVHD发生。但是由于Treg外周血中含量低阻碍Treg进一步研究甚至其临床应用。nTreg从外周血分离出来太少以至于达不到临床疗效。体外扩增从外周血提取人类FoxP3+Treg细胞的临床试验正在进行中，但目前主要障碍是纯化CD25+T细胞可能含有污染物非调节性T细胞。近来研究表明，抗CD4单克隆抗体（GK1.5）可增加外周CD4+T细胞中CD4+CD25+FoxP3+Treg并且不改变其免疫抑制功能。因此，本实验旨在验证经抗CD4单克隆抗体预处理后，可否改变宿主Treg细胞，从而抑制GVHD发生。首先我们建立稳定，成熟的GVHD模型，然后将抗CD4单克隆抗体输入宿主体内，10天后给予辐射，同时输入脾细胞和骨髓细胞，后观察小鼠体重及存活时间，再通过组织病理进一步验证宿主组织炎症反应是否减轻。最后通过RT-PCR和流式细胞学等检测方法来探讨其分子机制。一、异基因造血干细胞移植后小鼠GVHD模型的建立目的：建立稳定可靠的异体干细胞移植后小鼠GVHD模型。方法：以C57BL/6小鼠为供鼠，从小鼠股骨、胫骨中分离骨髓细胞，破红，洗涤与计数备用。无菌取出小鼠脾脏，放入200目筛网上研磨滤过收集脾细胞，破红，洗涤后计数备用。两种细胞按不同比例混合输入已照射受体BALB／c小鼠，观察受体小鼠有无疲惫、厌食、体重减轻、弓背、脱毛、腹泻等GVHD临床症状，并比较各组中位生存时间和组织病理学变化。结果：输入骨髓细胞5×106个，可以保证骨髓移植成功，同时输入脾细胞至少为5×106个时，即可发生GVHD，但小鼠存活时间不同。结论：当输入骨髓细胞5×106个和脾细胞5×106个可建立稳定可靠小鼠GVHD模型，小鼠中位生存时间为24d，适合于本实验的研究。二、抗CD4单克隆抗体预处理防治小鼠急性GVHD及分子机制初探目的：抗CD4单克隆抗体是否能防治小鼠GVHD的发生及分子机制探讨。方法：将24只体重相似8周BALB／c小鼠随机分为2组，每组12只，分别为对照组（A）和实验组（B）。B组给予尾静脉注射抗CD4单克隆抗体，A组给予尾静脉注射同型对照Ig，10天后，24只小鼠同时给予8.0Gy辐射后，给予尾静脉输入骨髓细胞5×106个和脾细胞5×106个。术后比较两组小鼠GVHD的临床症状的轻重、中位生存时间、组织病理学的变化及GVHD靶向器官T细胞的比例和含量。并用流式细胞术检测术后4h和7d两组脾细胞、外周血单核细胞CD4细胞中Treg比例，进一步通过混合淋巴细胞反应和Concanavalin A细胞增殖实验方法检测两组Treg细胞免疫抑制功能是否正常，再通过RT-PCR法检测术后5d、10d两组受体脾脏CD25+细胞中INF-γ、TGF-β和IL-10表达。结果：实验组比对照组相比可明显改善GVHD临床分数、延长小鼠中位生存时间及组织病理学和流式细胞术都证实在肝、皮肤、胃肠组织T细胞侵润减轻。进一步研究表明：经抗CD4单克隆抗体处理后，受体小鼠外周CD4+细胞含量降低，但是在外周血CD4+细胞中CD4+CD25+FoxP3+T细胞含量显著增加，且Treg细胞免疫抑制功能正常的，同时RT-PCR检测到术后CD25+细胞中TGF-β和IL-10表达增加。结论：抗CD4单克隆抗体可能通过增加宿主外周血Treg含量以及其分泌抑制性细胞因子TGF-β和IL-10来抑制T细胞炎症浸润和迁移，从而抑制GVHD的发生。