细胞进行增殖时,除了需要将遗传物质DNA准确的传递给子细胞,还要将DNA甲基化谱式准确传承,这对于细胞命运和功能的维系至关重要。DNMT1是维持DNA甲基化谱式的关键酶。近年来发现HSAN1E（Hereditary Sensory and Autonomic Neuropathy type 1E）和 ADC A-DN（Autosomal Dominant Cerebellar Ataxia-Deafness and Narcolepsy）两种神经退行性疾病的病因是DNMT1的DNA复制位点靶向顺序（RFTS）结构域的点突变。然而,到目前为止,这些DNMT1 RFTS结构域的突变如何影响体内DNMT1功能并因此导致神经退行性疾病产生尚不清楚,因此我们构建了Dnmt1 RFTS点突变的小鼠,研究突变对DNMT1蛋白的影响及导致疾病产生的可能机制。我们通过基因编辑技术构建了的Dnmt1 Y500C（Dnmt1-M1）、P496Y（Dnmt1-M2）点突变小鼠（与HSAN1E患者中发现突变位点对应）和Dnmt1 C585R（Dnmt1-M6）点突变小鼠（与ADCA-DN患者中发现突变位点对应）。我们的研究表明,三种基因型的纯合突变小鼠在胚胎10.5天左右死亡,并表现出明显缺乏DNMT1蛋白,而杂合子则可以存活、可育并且在生长和外观上没有明显异常。DNA甲基化检测发现这些杂合子小鼠在各个组织中存在轻度DNA甲基化下降。行为学及神经干细胞研究表明杂合子小鼠具有神经退行性疾病表型,包括学习和记忆受损,神经干细胞的增殖和分化活性降低。对DNMT1蛋白的检测发现,在杂合子小鼠中,各组织的DNMT1蛋白水平只有野生型小鼠的一半左右。通过制备不同基因型的小鼠胚胎干细胞我们对突变如何影响DNMT1蛋白水平进行了深入研究,发现RFTS突变不影响Dnmt1基因的转录和mRNA水平,但显著降低突变体DNMT1蛋白的稳定性。我们发现DNMT1突变蛋白稳定性的下降不是由于突变蛋白对蛋白酶体降解的敏感性增加或者自噬降解的增强,而是由于突变的DNMT1蛋白在RFTS结构域内部受到特异蛋白酶的酶切。虽然这个特异蛋白酶还没有被鉴定,但我们发现该蛋白酶酶切所产生的N-端DNMT1片段特异定位到核仁并形成聚集体（foci）。为了研究DNMT1的RFTS突变是否在人类细胞中也诱导DNMT1的特异蛋白酶降解,我们通过单碱基编辑技术在HS683（人脑视神经胶质瘤细胞）中构建内源DNMT1 Y495C点突变的细胞系,发现该突变导致细胞增殖受损并同样出现DNMT1的核仁定位,说明在人和小鼠中突变DNMT1的致病机制具有一定的相似性。需要说明的是,我们通过单碱基编辑技术也在HeLa细胞中构建了DNMT1 Y495C点突变的细胞系,表明突变的DNMT1在没有被酶切的情况下,其蛋白稳定性、细胞定位以及酶活性与野生型DNMT1相比没有明显的改变。这些研究表明RFTS突变引起的DNMT1降解,而不是突变本身,是导致DNMT1突变体功能缺陷的原因,并且很可能导致HSAN1E和ADCA-DN患者的神经退行性疾病表型。综上所述,我们从生化和生理的层面上说明了 DNMT1的RFTS区域点突变造成HSAN1E疾病产生的机制,并对ADCA-DN的致病机制进行了初步的探索,这对临床上HSAN1E和ADCA-DN疾病的研究和治疗提供了新的重要信息。