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研究背景肝癌（liver cancer）是在世界范围内发病率居第六位,死亡率居第三位的恶性肿瘤性疾病。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌中最常见的病理类型,研究显示HCC约占所有肝癌病例的75%-78%。近年来随着医学影像设备和技术的不断进步,早期肝癌的诊断率明显提高。但由于肝癌起病隐匿,很多病人在明确诊断时已经进展为晚期或者发生了转移,目前针对肝癌的靶向药物较少且易产生耐药性,因此许多晚期肝癌病人的预后仍不理想,5年总生存率仍不足30%。所以深入探索肝癌发生和进展的潜在机制、研究早期诊断和预后标志物、开发新型有效的药物治疗靶点、阻止肝癌转移对降低肝癌的死亡率、提高患者生活质量具有非常重要的意义。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）是RNA中最常见的表观修饰方式之一,其在机体生理及病理进程中的具体作用和机制已成为生命科学领域的新兴热点。许多研究发现m6A修饰介导了众多的生理和病理进程,例如肥胖症、神经系统疾病和自身免疫疾病等。在肿瘤中m6A修饰被证实可通过调控编码基因或非编码基因（miRNA、lncRNA或circRNA等）发挥促癌或者抑癌的作用。但m6A参与肝癌恶性进展及免疫浸润的具体机制尚不清楚,亟需进一步探索。目的本研究拟基于前期整合的公共数据库表达谱数据,联合课题组前期构建的肝癌组织芯片队列,分析22个m6A相关基因在肝癌和癌旁组织中的表达差异;探索不同的m6A修饰亚型与肝癌临床特征和预后的关系;研究不同m6A修饰亚型所对应的肝癌免疫微环境特征;探究在肝癌免疫浸润中起关键作用的m6A相关基因,从肝癌组织层面验证YTHDF1蛋白对CD3和CD8阳性T细胞浸润程度的影响。方法1.整合肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）、国际肿瘤基因组协作组（International Cancer Genome Consortium,ICGC）和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）中的肝癌表达谱数据,联合课题组前期构建的肝癌组织芯片队列,探索22个m6A调节基因mRNA和蛋白质在肝癌和癌旁组织中的表达差异。应用综合生物信息学分析技术探索22个m6A调节基因与肝癌预后、体细胞突变和拷贝数变异的关系。2.利用TCGA中的肝癌表达谱数据,采用一致性聚类分析方法鉴定肝癌中不同的m6A修饰亚型,并应用差异分析、卡方检验和生存分析探索不同的m6A修饰亚型与肝癌进展、预后和临床特征的关系。3.运用单样本基因集富集分析（Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis,ssGSEA）和基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis,GSVA）研究 m6A 修饰亚型与肝癌免疫微环境特征的关系,探索m6A修饰参与肝癌进展、塑造肝癌免疫微环境的潜在机制。4.利用免疫组化和多重免疫荧光技术研究YTHDF1表达水平与肝癌组织中CD3、CD8阳性T淋巴细胞浸润之间的关系。结果1.差异分析显示 WTAP、KIAA1429、RBM15、METTL3、HNRNPA2B1、HNRNPG、YTHDF1、YTHDF2、IGF2BP2、IGF2BP3 和 EIF3A 在 mRNA 和蛋白水平均在肝癌组织中显著高表达（P＜0.05）,同时肝癌病人中存在广泛的m6A调节基因的体细胞突变和拷贝数变异。单因素Cox回归分析显示METTL3、WTAP、HNRNPG、KIAA1429、RBM15、HNRNPA2B1、RBM15、HNRNPC、YTHDF1 和 YTHDF2 是肝癌总生存期（Over-all survival,OS）和无进展生存期（Progression free survival,PFS）的潜在危险因素。2.肝癌临床特征和预后分析显示,m6A亚型1（cluster 1）中除IGFBPs外,其余m6A调节基因为中度表达,该亚型生存优势最为显著;m6A亚型2（cluster 2）中m6A调节基因普遍高表达,与晚期TNM分级（Ⅲ/Ⅳ）、晚期组织学分级（G3/G4）、血清AFP升高和血管侵犯密切相关,其预后最差。m6A亚型3（cluster 3）中IGF2BP1和IGF2BP2高表达,生存优势居中。3.通路评分和免疫浸润分析显示,m6A亚型1表现为免疫激活型肝癌的特征,其特点为TGF-β及Wnt通路评分降低和效应T细胞（CD8+T cells）、细胞毒性细胞（Cytotoxic cells）,树突状细胞（Dendritic cells）、辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）浸润水平增加;m6A亚型2具备免疫荒漠型肝癌的特征,其特点为wnt通路的显著富集和辅助型T细胞2（T helper 2 cell,Th2）浸润程度显著升高;m6A亚型3具有免疫耗竭型肝癌的特征,其特点为TGF-β通路显著富集和较低的CD8+T细胞的浸润。4.免疫组化和多重免疫荧光显示YTHDF1蛋白高表达时,CD3和CD8阳性T细胞的浸润程度显著降低;YTHDF1蛋白低表达时,CD3和CD8阳性T细胞的浸润程度显著升高。结论1.m6A 调节基因（WTAP、KIAA1429、RBM15、METTL3、HNRNPA2B1、HNRNPG、YTHDF1、YTHDF2、IGF2BP2、IGF2BP3 和EIF3A）在肝癌组织中显著高表达;肝癌中m6A调节基因存在普遍的体细胞突变和拷贝数变异。2.m6A亚型1生存优势最为显著,m6A亚型2预后最差且与肝癌晚期病理分级显著相关,m6A亚型3生存优势居中。3.m6A亚型1体现出免疫激活型肝癌的特征,m6A亚型2亚型具备免疫荒漠型肝癌的特点,m6A亚型3亚型具有免疫耗竭型肝癌的特征。4.YTHDF1蛋白高表达显著抑制肝癌组织中CD3和CD8阳性T淋巴细胞的浸润。