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副溶血性弧菌是一种革兰阴性菌,无芽胞,通常呈杆状,弧状。该菌一般生长在海水以及海口环境中。副溶血性弧菌一般寄宿在鱼、虾、蟹体内,造成鱼、虾、蟹的大量死亡,给水产养殖带来经济损失。人如果误食了带有副溶血弧菌的海产品,会引起腹痛、腹泻、呕吐等临床症状。EnvZ/OmpR是广泛存在于细菌中的一对双组分系统,由跨膜信号传感器EnvZ和效应器OmpR组成。传感器EnvZ能够将外界刺激转化为信号分子,完成磷酸化后将磷酸基团转移给效应器OmpR,促使其磷酸化。磷酸化后的OmpR能够调节其下游相关基因的表达,从而使细菌适应外界恶劣环境。目前,EnvZ/OmpR在多种细菌中被研究报道,该系统在许多细菌中都发挥着重要功效。然而,这对双组分系统在副溶血弧菌菌株RMID2210633中是否存在,是否会调控副溶血弧菌的生理功能,以及如何发挥作用尚不清楚。但有研究表明EnvZ/OmpR能够调提高大肠杆菌在高渗透压下的存活率;另外EnvZ/OmpR还能够调控霍乱弧菌的耐碱能力。1.副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）双组分系统EnvZ/OmpR的鉴定本研究首先利用在线工具smart对副溶性血弧菌蛋白结构功能进行预测,结果表明vp0154的编码蛋白具有REC Domain（该结构域含有被组氨酸激酶磷酸化的磷酸受体位点）和Transreg C domain该域与REC结构域相关联,具有DNA结合能力),这两个结构域属于反应调控蛋白的保守结构域;vp0155的编码蛋白具有HAMP domain（含有跨膜结构域）,HisKA domain（含组氨酸激酶的二聚化和磷酸受体结构域）,HATPase c domain（具有组氨酸激酶活性）,这三个结构域都属于组氨酸蛋白激酶的保守性结构域。为进一步确认vp0155/vp0154是否编码了副溶血性弧菌中EnvZ/OmpR同源蛋白。本实验将VP0155/VP0154和其它已鉴定出存在EnvZ/OmpR的菌株进行了 Blast同源性分析,结果表明副溶血性弧菌基因组中vp0154的编码蛋白和霍乱弧菌MS6菌株中的OmpR蛋白同源性高达92%,和大肠杆菌MG1665菌株的OmpR同源性达到了 84%;vp0155的编码蛋白和霍乱弧菌MS6菌株中的EnvZ蛋白同源性高达78%,和大肠杆菌MG1665菌株的EnvZ同源性达到了 50%。以上结果表明,vp0155/vp0154在副溶血性弧菌编码Envz/OmpR的同源蛋白。2.EnvZ/OmpR对副溶血性弧菌生理功能影响的探究对副溶血性弧菌进行了envZ/ompR（vp0155/vp0154）缺失株的构建后,对缺失株的相关表型进行了测定。首先是正常培养条件下的生长,实验结果显示不论缺失envZ还是ompR对于副溶血性弧菌在正常MLB条件下的生长都没有影响。为了探究在高渗透压下的ΔenvZ和ΔompR缺失株生长是否会受影响,实验结果表明缺失envZ对副溶血性弧菌在高渗下的生长没有影响,但是OmpR对副溶血性弧菌在高渗下的生长起到了重要作用。同样对缺失株在酸碱条件下的生长进行检测发现,EnvZ并不参与副溶血性弧菌的耐酸耐碱作用,但是OmpR对于副溶血性弧菌的耐碱胁迫有着重要作用。通过对Δ envZ和Δ ompR缺失株进行生物膜形成量和运动能力的检测发现,相较于野生株,缺失envZ的菌株生物膜形成量明显减少,缺失ompR不影响副溶血性弧菌生物膜形成。此外,通过对envZ/ompR缺失株副溶运动能力的检测发现,EnvZ对于副溶血性弧菌的爬动运动和泳动运动都具有明显的正向调控,而OmpR对于副溶血性弧菌的运动能力却没有明显调控作用。3.EnvZ/OmpR影响副溶血性弧菌耐碱机制研究为了进一步探究EnvZ/OmpR参与副溶血性弧菌抗碱胁迫的作用机制,本研究筛选了一些可能受OmpR调控的外膜蛋白基因,并提取野生株和ompR缺失株的RNA进行了 qRT-PCR分析。结果显示,外膜蛋白基因vp0493、vp1218、vpa0085、vpa1308和vpa1745在ompR缺失株中表达均显著降低,说明OmpR正向调控这几个基因的表达。分别构建这几个基因的缺失株并对它们进行碱性条件下生长曲线测定时发现Δvp0493、Δvp1218、Δvpa0085和Δvpa1745这几个缺失株在正常条件下的生长能力和野生型没有区别,但是它们在碱性条件下的生长能力均明显弱于野生型。这个表型和ΔompR缺失株一致,间接说明OmpR调控调控这些外膜蛋白基因,进而促进副溶血性弧菌的耐碱性。通过构建副溶血性弧菌aphB（vp2184）的缺失株,并对其在碱性条件下的生长进行测定来探究副溶血性弧菌中,OmpR对外膜蛋白的调节是否通过AphB。试验结果显示aphB缺失菌株在碱性条件下的生长要明显强于野生株,这说明aphB会抑制副溶血性弧菌在碱性环境下的生存。通过构建荧光检测系统来探究OmpR是否会调控aphB的表达以及AphB是否会调控相关外膜蛋白的表达。实验结果表明,OmpR能够抑制aphB的表达,并且AphB能够抑制vp0493、vp1218和vpa0085等外膜蛋白的表达。以上结果表明,OmpR可通过抑制调控因子aphB的表达,以促进外膜蛋白基因vp0493、vp1218和vpa0085的表达,从而提高副溶血性弧菌在碱性条件下的适应性。综上所述,本研究发现副溶血性弧菌基因组中vp0155/vp0154编码了双组分系统EnvZ/OmpR的同源蛋白,并且该EnvZ/OmpR能够调控副溶血性弧菌耐高渗透压、耐碱性、生物膜和运动能力等多个生理功能。对EnvZ/OmpR进行分子机制的研究发现,响应调节蛋白OmpR在碱性环境下能够通过抑制aphB的表达,间接正向调控外膜蛋白vp0493、vp1218和vpa0085的表达以提高副溶血性弧菌的耐碱能力。本实验探究了 EnvZ/OmpR对副溶血性弧菌生理功能的影响。并且利用荧光定量PCR和荧光检测系统对副溶血性弧菌的耐碱机制进行研究。为探究副溶血性弧菌对于恶劣环境的适应机制提供了参考。