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研究背景及目的：
肺癌是人类最常见的肿瘤之一，因其高发病率、高致死率位居恶性肿瘤前列。患者被确诊肺癌时常因局部侵犯或远处转移而错过最佳手术时机。肺癌的转移或复发是肺癌患者死亡的主要原因，目前，其发生机制尚不完全清楚，尽管靶向药物使肺癌治疗取得了很大进步，但对于出现远处转移的患者5年生存期及生存质量并没有实质性的提高和改善。众所周知，对因治疗是控制疾病的根本，而肺癌发生发展的本质是多因素导致基因的异常表达，故从基因角度对肺癌进行研究也是控制肺癌转移的关键。
大数据时代，高通量基因测序技术与生物信息学分析技术得到快速的发展。依据多种生物数据库对癌症相关生物信息进行多维度综合分析已成为挖掘、研究癌基因的有效手段。其中GEO是全世界最大的综合基因芯片信息储存数据库；TCGA数据库为33种癌症提供了全面、多维度的基因测序信息，以及相关的临床随访资料。为此，本研究利用GEO数据库，筛选出2个关于NSCLC细胞系转移相关基因芯片表达数据集，分析得到NSCLC高转移性差异基因集，并进行功能富集分析。再结合TCGA中肺腺癌基因的表达量和对应患者的临床生存信息，将这些差异基因集进行COX分析，最终选出与肺腺癌患者生存期紧密相关的核心基因DEPDC1。
DEPDC1基因位于1p31.3区域，其编码的蛋白质高度保守，在膀胱癌、肝细胞癌、前列腺癌等疾病中均有高表达并影响肿瘤的发生、发展，而在肺癌转移中的作用及机制却鲜有报道。因DEPDC1基因来源于高转移性肺癌细胞系基因芯片表达数据集差异筛选分析，推断DEPDC1是与肺腺癌转移密切相关的基因，故本研究对DEPDC1与肺腺癌发生及转移的分子生物学机制进行初步探讨，为寻找治疗肺腺癌转移的新靶点奠定理论基础。为此，本研究包含以下四部分：第一部分：NSCLC转移相关基因的生物信息学分析及关键基因筛选；第二部分：DEPDC1基因在肺腺癌中表达及其临床意义；第三部分：DEPDC1对肺腺癌细胞株A549、Calu3生物学行为的影响；第四部分：DEPDC1影响肺腺癌侵袭迁移的机制探究。
第一部分：NSCLC转移相关基因生物信息学分析及关键基因筛选
研究方法：
1、以“lungcancer”、“metastasis”为关键词，在NCBI的GEODataSets中进行检索，筛选出符合研究要求的样本集。
2、通过R语言对样本集进行数据预处理，算出差异基因，求出共表达差异基因。
3、共表达差异基因进行GO功能富集分析。
4、TCGA检索并下载肺腺癌RNA-seq数据及临床信息数据，相互匹配获取具有临床随访的肺腺癌RNA-seq数据。
5、通过Cox比例风险回归模型将GO富集出有意义的基因，并以GOterm为单元进行分析，绘制ROC曲线，获得交集基因，以p<0.01为纳入标准，最终获得关键基因。
6、通过TCGA数据库验证该基因的表达及生存预后。
研究结果：
1、在GEO的DataSets中检索出GSE76194，GSE10096两个肺癌转移相关样本集。
2、GES76194和GSE10096共表达差异基因共86个，其中46个上调基因，40个下调基因。
3、GO功能富集分析结果显示：BiologyProcess主要集中在信号转导、负调节血管生成等；CellularComponent主要集中在细胞质、粘着斑等；MolecularFunction主要集中在蛋白结合。
4、在TCGA中检索获得肺腺癌RNA-seq数据594例，最终获得504例有临床随访信息的肺腺癌RNA-seq数据。
5、GO:0007165，GO:0005515与患者预后生存相关性最大。前者纳入6个有效基因，AUC=0.703；后者纳入15个有效基因，AUC=0.724，两者取交集获得基因DEPDC1、ADM，其中DEPDC1的表达p值均小于0.01。
6、TCGA数据库发现肺腺癌组织中的DEPDC1明显高于正常对照组，且高表达组患者总体生存率明显低于DEPDC1低表达组，p=0.0049。
小结：
1、分析GSE76194，GSE10096芯片数据，结合TCGA数据库，通过功能富集分析、Cox回归模型综合分析获得与肺腺癌转移预后关键基因DEPDC1。
第二部分：DEPDC1基因在肺腺癌中的表达及其临床意义
研究方法：
1、采用RT-PCR检测常见肺腺癌细胞系中DEPDC1mRNA水平。
2、采用RT-PCR检测在58对配对的肺腺癌组织与癌旁组织DEPDC1mRNA相对表达水平，并分析其与临床病理特征的相关性。
3、采用免疫组化方法检测49例肺腺癌患者组织中DEPDC1蛋白表达水平，并分析其与临床病理特征的相关性。
4、DEPDC1蛋白表达与患者预后相关性分析。
研究结果：
1、DEPDC1在95D、A549、Calu3、H322、H460细胞系中均高表达。
2、58对肺腺癌患者配对的组织中，与对照组相比75.86%(44/58)患者肺癌组织DEPDC1mRNA高表达，p＜0.01,差异具有统计学意义，且与T分类、淋巴结转移、临床分期以及分化程度相关，p＜0.05。
3、49例肺腺癌组织标本中DEPDC1蛋白表达阳性率为73.47%(36/49)，p＜0.01，且与T分类、淋巴结转移、临床分期以及分化程度相关，p＜0.05。
4、DEPDC1高表达的总体生存率明显低于DEPDC1低表达组，p=0.0238。小结
1、DEPDC1基因在肺腺癌中高表达。
2、DEPDC1在肺腺癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，与患者的T分期、淋巴转移、临床分期密切相关。
3、DEPDC1的表达与患者生存期显著相关，提示DEPDC1可作为判断肺腺癌患者预后的一个重要指标。
第三部分：DEPDC1对肺腺癌细胞株A549、Calu3生物学行为的影响
研究方法：
1、构建沉默DEPDC1基因的肺腺癌Calu3细胞株，流式细胞仪验证转染效率，用WesternBlot和RealtimePCR方法验证DEPDC1的表达情况。
2、通过CCK8、细胞划痕、Transwell、平板克隆实验方法探讨沉默DEPDC1基因后对肺癌细胞株Calu3生物学行为的影响。
3、构建过表达DEPDC1基因的肺腺癌A549细胞株，流式细胞仪验证转染效率，用WesternBlot和RealtimePCR方法验证DEPDC1的过表达情况。
4、通过CCK8、细胞划痕、Transwell、平板克隆实验方法探讨DEPDC1过表达对肺癌细胞株A549生物学行为的影响。
5、构建沉默、过表达DEPDC1的荷瘤裸鼠模型，测量瘤体生长曲线，观察裸鼠生长情况。
研究结果：
1、沉默DEPDC1基因的Calu3细胞系转染效率大于80%，其DEPDC1mRNA和蛋白水平显著降低。
2、沉默DEPDC1基因能够抑制Calu3的增殖、迁移、侵袭、自我更新能力。
3、过表达DEPDC1基因的A549细胞系转染效率大于80%，其DEPDC1mRNA和蛋白水平显著升高。
4、过表达DEPDC1基因能够促进A549增殖、迁移、侵袭、自我更新能力。
5、在体内实验中，DEPDC1的高表达促进荷瘤裸鼠瘤体形成，沉默DEPDC1基因能够降低抑制瘤体的增殖生长。
小结：
1、沉默DEPDC1基因能够抑制肺腺癌细胞系Calu3的增殖、迁移、侵袭、自我更新能力。
2、高表达DEPDC1基因能够促进肺腺癌细胞系A549的增殖、迁移、侵袭、自我更新能力。
3、DEPDC1基因促进荷瘤裸鼠瘤体对瘤体的增殖生长，沉默该基因后该作用被抑制。
第四部分：DEPDC1影响肺腺癌侵袭迁移的机制探究
研究方法：
1、Westernblot检测沉默、过表达DEPDC1基因的肺腺癌细胞株中E-cad、N-cad、Vim的表达情况。
2、收集过表达DEPDC1细胞系的上清与A549共培养，通过划痕、transwell验证是否是上清中的一些因子影响肺癌细胞EMT。
3、运用CytometricBeadArray技术检验过表达、沉默DEPDC1基因的细胞株上清中多种细胞因子含量的差异。
4、RealtimePCR检测过表达及沉默DEPDC1基因的细胞中IL-8表达情况，ELISA检测细胞系上清中IL-8水平的表达差异。
5、划痕、Transwell检测加入外源性IL-8对沉默DEPDC1基因的细胞系侵袭、迁移能力的影响。
6、Westernblot检测沉默及过表达组细胞系中pNF-κB蛋白表达的情况。划痕实验探究加入NF-κB通路阻断剂QZN对过表达、沉默DEPDC1基因细胞株迁移运动的影响。ELISA检测NF-κB的阻断剂(QNZ)影响下过表达DEPDC1细胞系培养上清中IL-8的表达情况。
7、体内实验ELISA检测不同荷瘤裸鼠体内IL-8的表达情况。
8、DEPDC1的表达与肺腺癌患者肿瘤组织中IL-8的相关性分析
研究结果：
1、在沉默DEPDC1基因的细胞系中，E-Cad表达升高，而N-Cad、Vim的表达显著降低，p＜0.05。在过表达DEPDC1细胞系中，E-Cad表达显著降低，N-Cad、Vim的表达显著升高，p＜0.05。
2、过表达DEPDC1细胞系的上清中存在某种因子促进了细胞的侵袭迁移运动。
3、CytometricBeadArray检测显示IL-8的差异最具有统计学意义。
4、RealtimePCR检测显示过表达DEPDC1的细胞中IL-8表达显著升高，p＜0.05；沉默DEPDC1的IL-8表达下降，p＜0.01。ELISA检测DEPDC1过表达细胞上清IL-8表达明显升高，p＜0.001；沉默DEPDC1之后细胞系上清中IL-8的明显抑制，p＜0.01。
5、划痕、Transwell实验显示：沉默DEPDC1基因细胞迁移侵袭受到抑制，加入外源性IL-8之后，细胞迁移侵袭程度增加，且具有统计学差异，p＜0.01。
6、Westernblot检测显示沉默DEPDC1的pNF-κB表达受到抑制，过表达DEPDC1的pNF-κB表达增强，说明DEPDC1与pNF-κB表达正相关。划痕实验显示加入QNZ以后促进细胞的迁移运动。ELISA检测显示加入抑制剂QNZ后细胞IL-8的表达降低，p＜0.01。
7、发现DEPDC1促进IL-8的表达，当该基因沉默后IL-8的表达明显抑制，p＜0.05。
8、肺腺癌患者中DEPDC1的表达与IL-8成正相关，r=0.520,p＜0.01。
小结：
1、过表达DEPDC1使得肺腺癌发生EMT进而促进其转移。
2、DEPDC1通过调节IL-8的表达来影响肺腺癌细胞的侵袭迁移。
3、DEPDC1通过影响NF-κB的活性进而调节IL-8的表达，促进肺腺癌的侵袭迁移。
肺癌是人类最常见的肿瘤之一，因其高发病率、高致死率位居恶性肿瘤前列。患者被确诊肺癌时常因局部侵犯或远处转移而错过最佳手术时机。肺癌的转移或复发是肺癌患者死亡的主要原因，目前，其发生机制尚不完全清楚，尽管靶向药物使肺癌治疗取得了很大进步，但对于出现远处转移的患者5年生存期及生存质量并没有实质性的提高和改善。众所周知，对因治疗是控制疾病的根本，而肺癌发生发展的本质是多因素导致基因的异常表达，故从基因角度对肺癌进行研究也是控制肺癌转移的关键。
大数据时代，高通量基因测序技术与生物信息学分析技术得到快速的发展。依据多种生物数据库对癌症相关生物信息进行多维度综合分析已成为挖掘、研究癌基因的有效手段。其中GEO是全世界最大的综合基因芯片信息储存数据库；TCGA数据库为33种癌症提供了全面、多维度的基因测序信息，以及相关的临床随访资料。为此，本研究利用GEO数据库，筛选出2个关于NSCLC细胞系转移相关基因芯片表达数据集，分析得到NSCLC高转移性差异基因集，并进行功能富集分析。再结合TCGA中肺腺癌基因的表达量和对应患者的临床生存信息，将这些差异基因集进行COX分析，最终选出与肺腺癌患者生存期紧密相关的核心基因DEPDC1。
DEPDC1基因位于1p31.3区域，其编码的蛋白质高度保守，在膀胱癌、肝细胞癌、前列腺癌等疾病中均有高表达并影响肿瘤的发生、发展，而在肺癌转移中的作用及机制却鲜有报道。因DEPDC1基因来源于高转移性肺癌细胞系基因芯片表达数据集差异筛选分析，推断DEPDC1是与肺腺癌转移密切相关的基因，故本研究对DEPDC1与肺腺癌发生及转移的分子生物学机制进行初步探讨，为寻找治疗肺腺癌转移的新靶点奠定理论基础。为此，本研究包含以下四部分：第一部分：NSCLC转移相关基因的生物信息学分析及关键基因筛选；第二部分：DEPDC1基因在肺腺癌中表达及其临床意义；第三部分：DEPDC1对肺腺癌细胞株A549、Calu3生物学行为的影响；第四部分：DEPDC1影响肺腺癌侵袭迁移的机制探究。
第一部分：NSCLC转移相关基因生物信息学分析及关键基因筛选
研究方法：
1、以“lungcancer”、“metastasis”为关键词，在NCBI的GEODataSets中进行检索，筛选出符合研究要求的样本集。
2、通过R语言对样本集进行数据预处理，算出差异基因，求出共表达差异基因。
3、共表达差异基因进行GO功能富集分析。
4、TCGA检索并下载肺腺癌RNA-seq数据及临床信息数据，相互匹配获取具有临床随访的肺腺癌RNA-seq数据。
5、通过Cox比例风险回归模型将GO富集出有意义的基因，并以GOterm为单元进行分析，绘制ROC曲线，获得交集基因，以p<0.01为纳入标准，最终获得关键基因。
6、通过TCGA数据库验证该基因的表达及生存预后。
研究结果：
1、在GEO的DataSets中检索出GSE76194，GSE10096两个肺癌转移相关样本集。
2、GES76194和GSE10096共表达差异基因共86个，其中46个上调基因，40个下调基因。
3、GO功能富集分析结果显示：BiologyProcess主要集中在信号转导、负调节血管生成等；CellularComponent主要集中在细胞质、粘着斑等；MolecularFunction主要集中在蛋白结合。
4、在TCGA中检索获得肺腺癌RNA-seq数据594例，最终获得504例有临床随访信息的肺腺癌RNA-seq数据。
5、GO:0007165，GO:0005515与患者预后生存相关性最大。前者纳入6个有效基因，AUC=0.703；后者纳入15个有效基因，AUC=0.724，两者取交集获得基因DEPDC1、ADM，其中DEPDC1的表达p值均小于0.01。
6、TCGA数据库发现肺腺癌组织中的DEPDC1明显高于正常对照组，且高表达组患者总体生存率明显低于DEPDC1低表达组，p=0.0049。
小结：
1、分析GSE76194，GSE10096芯片数据，结合TCGA数据库，通过功能富集分析、Cox回归模型综合分析获得与肺腺癌转移预后关键基因DEPDC1。
第二部分：DEPDC1基因在肺腺癌中的表达及其临床意义
研究方法：
1、采用RT-PCR检测常见肺腺癌细胞系中DEPDC1mRNA水平。
2、采用RT-PCR检测在58对配对的肺腺癌组织与癌旁组织DEPDC1mRNA相对表达水平，并分析其与临床病理特征的相关性。
3、采用免疫组化方法检测49例肺腺癌患者组织中DEPDC1蛋白表达水平，并分析其与临床病理特征的相关性。
4、DEPDC1蛋白表达与患者预后相关性分析。
研究结果：
1、DEPDC1在95D、A549、Calu3、H322、H460细胞系中均高表达。
2、58对肺腺癌患者配对的组织中，与对照组相比75.86%(44/58)患者肺癌组织DEPDC1mRNA高表达，p＜0.01,差异具有统计学意义，且与T分类、淋巴结转移、临床分期以及分化程度相关，p＜0.05。
3、49例肺腺癌组织标本中DEPDC1蛋白表达阳性率为73.47%(36/49)，p＜0.01，且与T分类、淋巴结转移、临床分期以及分化程度相关，p＜0.05。
4、DEPDC1高表达的总体生存率明显低于DEPDC1低表达组，p=0.0238。小结
1、DEPDC1基因在肺腺癌中高表达。
2、DEPDC1在肺腺癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，与患者的T分期、淋巴转移、临床分期密切相关。
3、DEPDC1的表达与患者生存期显著相关，提示DEPDC1可作为判断肺腺癌患者预后的一个重要指标。
第三部分：DEPDC1对肺腺癌细胞株A549、Calu3生物学行为的影响
研究方法：
1、构建沉默DEPDC1基因的肺腺癌Calu3细胞株，流式细胞仪验证转染效率，用WesternBlot和RealtimePCR方法验证DEPDC1的表达情况。
2、通过CCK8、细胞划痕、Transwell、平板克隆实验方法探讨沉默DEPDC1基因后对肺癌细胞株Calu3生物学行为的影响。
3、构建过表达DEPDC1基因的肺腺癌A549细胞株，流式细胞仪验证转染效率，用WesternBlot和RealtimePCR方法验证DEPDC1的过表达情况。
4、通过CCK8、细胞划痕、Transwell、平板克隆实验方法探讨DEPDC1过表达对肺癌细胞株A549生物学行为的影响。
5、构建沉默、过表达DEPDC1的荷瘤裸鼠模型，测量瘤体生长曲线，观察裸鼠生长情况。
研究结果：
1、沉默DEPDC1基因的Calu3细胞系转染效率大于80%，其DEPDC1mRNA和蛋白水平显著降低。
2、沉默DEPDC1基因能够抑制Calu3的增殖、迁移、侵袭、自我更新能力。
3、过表达DEPDC1基因的A549细胞系转染效率大于80%，其DEPDC1mRNA和蛋白水平显著升高。
4、过表达DEPDC1基因能够促进A549增殖、迁移、侵袭、自我更新能力。
5、在体内实验中，DEPDC1的高表达促进荷瘤裸鼠瘤体形成，沉默DEPDC1基因能够降低抑制瘤体的增殖生长。
小结：
1、沉默DEPDC1基因能够抑制肺腺癌细胞系Calu3的增殖、迁移、侵袭、自我更新能力。
2、高表达DEPDC1基因能够促进肺腺癌细胞系A549的增殖、迁移、侵袭、自我更新能力。
3、DEPDC1基因促进荷瘤裸鼠瘤体对瘤体的增殖生长，沉默该基因后该作用被抑制。
第四部分：DEPDC1影响肺腺癌侵袭迁移的机制探究
研究方法：
1、Westernblot检测沉默、过表达DEPDC1基因的肺腺癌细胞株中E-cad、N-cad、Vim的表达情况。
2、收集过表达DEPDC1细胞系的上清与A549共培养，通过划痕、transwell验证是否是上清中的一些因子影响肺癌细胞EMT。
3、运用CytometricBeadArray技术检验过表达、沉默DEPDC1基因的细胞株上清中多种细胞因子含量的差异。
4、RealtimePCR检测过表达及沉默DEPDC1基因的细胞中IL-8表达情况，ELISA检测细胞系上清中IL-8水平的表达差异。
5、划痕、Transwell检测加入外源性IL-8对沉默DEPDC1基因的细胞系侵袭、迁移能力的影响。
6、Westernblot检测沉默及过表达组细胞系中pNF-κB蛋白表达的情况。划痕实验探究加入NF-κB通路阻断剂QZN对过表达、沉默DEPDC1基因细胞株迁移运动的影响。ELISA检测NF-κB的阻断剂(QNZ)影响下过表达DEPDC1细胞系培养上清中IL-8的表达情况。
7、体内实验ELISA检测不同荷瘤裸鼠体内IL-8的表达情况。
8、DEPDC1的表达与肺腺癌患者肿瘤组织中IL-8的相关性分析
研究结果：
1、在沉默DEPDC1基因的细胞系中，E-Cad表达升高，而N-Cad、Vim的表达显著降低，p＜0.05。在过表达DEPDC1细胞系中，E-Cad表达显著降低，N-Cad、Vim的表达显著升高，p＜0.05。
2、过表达DEPDC1细胞系的上清中存在某种因子促进了细胞的侵袭迁移运动。
3、CytometricBeadArray检测显示IL-8的差异最具有统计学意义。
4、RealtimePCR检测显示过表达DEPDC1的细胞中IL-8表达显著升高，p＜0.05；沉默DEPDC1的IL-8表达下降，p＜0.01。ELISA检测DEPDC1过表达细胞上清IL-8表达明显升高，p＜0.001；沉默DEPDC1之后细胞系上清中IL-8的明显抑制，p＜0.01。
5、划痕、Transwell实验显示：沉默DEPDC1基因细胞迁移侵袭受到抑制，加入外源性IL-8之后，细胞迁移侵袭程度增加，且具有统计学差异，p＜0.01。
6、Westernblot检测显示沉默DEPDC1的pNF-κB表达受到抑制，过表达DEPDC1的pNF-κB表达增强，说明DEPDC1与pNF-κB表达正相关。划痕实验显示加入QNZ以后促进细胞的迁移运动。ELISA检测显示加入抑制剂QNZ后细胞IL-8的表达降低，p＜0.01。
7、发现DEPDC1促进IL-8的表达，当该基因沉默后IL-8的表达明显抑制，p＜0.05。
8、肺腺癌患者中DEPDC1的表达与IL-8成正相关，r=0.520,p＜0.01。
小结：
1、过表达DEPDC1使得肺腺癌发生EMT进而促进其转移。
2、DEPDC1通过调节IL-8的表达来影响肺腺癌细胞的侵袭迁移。
3、DEPDC1通过影响NF-κB的活性进而调节IL-8的表达，促进肺腺癌的侵袭迁移。