目的使用三种实验方法,在蛋白质和核酸水平,找出苯丙氨酸羟化酶在日本刺沙蚕中枢神经系统内存在的证据,为进一步寻找无脊椎动物体内芳香族氨基酸羟化酶基因分化的节点提供实验依据。方法1、运用Western blot实验方法,检测苯丙氨酸羟化酶在日本刺沙蚕中枢神经系统内是否有表达。2、制作石蜡切片,运用免疫组化技术,检测苯丙氨酸羟化酶在日本刺沙蚕中枢神经系统内的表达分布情况。3、运用RT-PCR技术,克隆PAH部分基因片段,通过构建重组质粒,筛选阳性克隆后测序,比对分析与其他物种PAH基因的同源性。结果1、Western blot结果标记出一条分子量大约为52 k Da的条带,表明在日本刺沙蚕中枢神经系统内存在PAH。2、免疫组织化学标记技术显示,PAH阳性神经元细胞主要分布在日本刺沙蚕前脑和中脑中腹处、背侧和两侧;腹神经索中也有阳性神经元胞体的分布。3、RT-PCR PAH基因克隆结果表明日本刺沙蚕中枢神经系统内有苯丙氨酸羟化酶基因存在。4、通过对克隆序列进行Blast比对分析,表明序列与多个物种PAH基因具有同源性。结论本实验证明了在低等无脊椎环节动物日本刺沙蚕中枢神经系统内存在PAH基因及其表达的蛋白,且与多种动物PAH具有同源性。