白斑综合征病毒(WSSV)是在全世界范围内为虾类养殖业带来损失最大的病毒之一,且目前尚缺乏有效的治疗措施,因此在WSSV感染的早期,能够实现对WSSV快速、定量检测,为预防控制该病的暴发、预警预报和减少经济损失具有重要意义。针对WSSV定量检测目前常采用聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR、双抗体夹心ELISA等方法,但是现有的这些检测方法在实际应用中皆在不同程度上受到花费高、耗时长、需要专业仪器等方面的限制,针对上述情况,本实验研制了一种WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸,其检测结果肉眼可见,不需要专业仪器设备,整个过程仅需要10min,适用于养殖现场的虾类、蟹类等甲壳类中WSSV的半定量快速检测。本实验具体如下所述,复苏WSSV单克隆抗体杂交瘤细胞2E6、1G12、3B7、4G9和5D2,利用辛酸-硫酸铵法纯化腹水单抗。选择单抗2E6作为金标抗体,以柠檬酸钠还原法制备胶体金,通过胶体金标记单抗2E6制备金标抗体,使用喷膜仪将制备的金标单抗2E6液体均匀喷涂到玻璃纤维上,即为金标垫,分别将不同浓度的单抗4G9包被于硝酸纤维素膜(NC膜)分别作为检测线T1,检测线T2和检测线T3,将羊抗小鼠IgG包被于硝酸纤维素膜(NC膜),作为质控线。并组装金标垫、NC膜与样品垫、吸收垫和塑料底板制成WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸。另外对其进行了优化,选择Whatman AE99作为WSSV检测试纸条的NC膜,单抗1G12、3B7、4G9、5D2按4：2：2：1的比例混合作为试纸条检测线抗体,优化后的试纸条的最低检测限为783ng/ml。使用WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸检测样品,若检测线T1、T2、T3和质控线都呈现红色时,说明WSSV蛋白浓度大于6.26μg/ml;若检测线T1、T2和质控线显现红色时,说明WSSV蛋白浓度位于3.13μg/ml-6.26μg/ml之间；若只有检测线T1和质控线显现红色时,说明WSSV蛋白浓度位于783ng/ml～3.13u g/ml;若只有质控线显现红色时,表明WSSV蛋白浓度小于783ng/ml,或者不含WSSV。建立了白斑综合征病毒实时荧光定量PCR技术,分别利用制备的WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸和建立的WSSV实时荧光定量PCR技术,跟踪检测了感染WSSV后克氏原螯虾(Procambarus clarkii)组织内病毒浓度的动态变化。注射WSSV粗提液感染克氏原螯虾,在感染后0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h分别取螯虾鳃、血淋巴、心脏、附肢、造血组织和肌肉,提取各组织DNA,实时荧光定量PCR测定WSSV浓度,结果显示,WSSV感染后3h在附肢、鳃、血淋巴和造血组织中检测到病毒,12h时在各样品组织中皆检测到病毒,但浓度较低；24-48h内WSSV浓度呈指数增长,此时螯虾出现少量死亡：60-72h内各组织中WSSV数量达到缓慢增长的平台期,螯虾累计死亡率快速增高。螫虾体内WSSV浓度与螯虾死亡率呈密切的正相关关系,其中附肢中WSSV动态变化趋势能够较好的代表多数样品组织中的WSSV增殖规律,因此在实验室及养殖场WSSV检测中可将附肢作为首选的检测组织。在感染WSSV后不同时间点WSSV在各组织中的分布也有很大差异,分析各组织中WSSV分布的差异,推测WSSV最先在血淋巴中大量复制,随后由于血淋巴循环造成对其它组织的感染。使用WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸检测血淋巴、鳃中不用时间点WSSV浓度,结果显示试纸条所测样品结果与实时荧光定量PCR检测结果一致率为100%。因而,WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸是一种快速、准确、适合于养殖现场使用的WSSV半定量检测方法。