【摘 要】
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蛋清溶菌酶是一种广泛存在于生物体中、安全性高、具有抗菌活性的碱性蛋白酶,常用作食品的防腐剂和保鲜剂。但是,溶菌酶属于非广谱抗菌剂,只能够有效地杀死革兰氏阳性菌（G+）,对革兰氏阴性菌（G-）的作用效果不显著。蛋清溶菌酶是一种具有免疫原性的蛋白质,并且,在中性和碱性的条件下热稳定性极差。酶解可以有效地解决上述问题。本课题采用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对溶菌酶进行双酶解,对酶解产物的抑菌活性和热稳定性进行探
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蛋清溶菌酶是一种广泛存在于生物体中、安全性高、具有抗菌活性的碱性蛋白酶,常用作食品的防腐剂和保鲜剂。但是,溶菌酶属于非广谱抗菌剂,只能够有效地杀死革兰氏阳性菌（G+）,对革兰氏阴性菌（G-）的作用效果不显著。蛋清溶菌酶是一种具有免疫原性的蛋白质,并且,在中性和碱性的条件下热稳定性极差。酶解可以有效地解决上述问题。本课题采用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对溶菌酶进行双酶解,对酶解产物的抑菌活性和热稳定性进行探究,再对其进行分离纯化,得到抑菌活性最强的抗菌肽,并对抗菌肽的抑菌机理进行初步探究,主要试验结果如下:首先,在酶最适反应条件下,用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对溶菌酶进行双酶解,得到双酶解产物Lyz-pp。双酶解产物失去全部酶活性,分子量主要分布在1000～5000 Da范围内,初步降低其免疫原性。双酶解产物的抗菌谱与蛋清溶菌酶基本一致,都对革兰氏阳性菌有良好的抑菌效果,对革兰氏阴性菌效果不显著,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别是1.25 mg/mL和2.5 mg/mL。在不同pH条件下,双酶解产物的热稳定性要强于溶菌酶和Nisin,但是随着pH的升高出现下降趋势。其次,通过Sephadex G-25凝胶层析柱,HiTrap SP HP阳离子交换柱以及制备型RP-HPLC三步对双酶解产物进行分离纯化,得到抗菌活性最强的抗菌肽F-2-3-1。抗菌肽经MALDI-TOF-MS得到单一峰,测得分子量为1418.2 Da,经LC-MC/MC鉴定和分析得到其氨基酸序列为KKIVSDGNGMNAW,对应蛋清溶菌酶N端第96-108位氨基酸残基。抗菌肽比双酶解产物具有更好的热稳定性,并且扩大了其抑菌谱,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为0.312 mg/mL和0.615 mg/mL,对大肠杆菌和沙门氏菌的最低抑菌浓度均为1.25 mg/mL。最后,对抗菌肽F-2-3-1的抑菌机理做了初步探究。经过抗菌肽处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞形态发生严重变形,细胞膜表面凹陷,出现孔洞,大肠杆菌的表面疏水性随着抗菌肽浓度的升高而降低,细胞外膜和内膜通透性都变大,细胞内K+出现外泄,说明抗菌肽是通过膜损伤机制在发挥作用。
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