癌症是威胁全人类健康与生命的不可忽视的敌人。胃癌是起源于胃黏膜上皮的常见恶性肿瘤,在消化系统肿瘤中发病率排名第一。世界上每年新增的胃癌病例有超过半数来自中国所在的东亚地区。目前在胃癌治疗中主要采用外科手术、放射性疗法和化学疗法。而在进行胃癌治疗时,通常伴随患者的是化疗药物高毒副作用所带来的痛苦。因此,寻找开发新的低毒或无毒副作用的新型药物和治疗方法迫在眉睫。目前已知昆虫超过100余万种,是地球上数量最多的动物群体。其中很多昆虫因具备药用功能而被用作治疗或者辅助治疗某种疾病,我国中医记载使用的药用昆虫就超过300种。已有研究表明多种昆虫中含有的抗菌肽,斑蝥素等生物活性物质能够发挥抗癌功能,而且相较于化疗药物,这类生物活性物质成药后毒副作用更小。近年来,家蚕天然活性物质的药用价值受到越来越多地关注,发掘其药用价值的潜力极大。大量研究表明,蛋白酶抑制剂是广泛用于癌症的辅助药物,但目前家蚕羧肽酶抑制剂作为抗肿瘤药物进行应用的研究尚无报道。家蚕是鳞翅目昆虫的一种典型代表,作为一种经济昆虫,人们不断对其进行科学研究,以期理解其变态发育调节和先天性免疫应答等生理过程。家蚕体壁和血液中含有丰富的天然活性物质,如蛋白酶及蛋白酶抑制剂,在家蚕多种生理生化过程中起重要作用,参与食物消化、抵御病原微生物等过程。科学家利用基因组学,蛋白组学等方法围绕丝氨酸蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶等及其抑制剂做了大量研究工作。但对于家蚕羧肽酶（Silkworm carboxypeptidases,Bm CP）与羧肽酶抑制剂（Silkworm carboxypeptidases inhibitor,Bm CPI）,目前尚缺乏系统研究,在家蚕中的分布情况和功能均不明确,其中本研究首次鉴定发现了羧肽酶抑制剂,它们的功能有待开发。自然界是筛选有效先导化合物的宝库,已有很多天然来源的活性成分作为先导化合物并最终成药。家蚕天然活性成分种类多,含量丰富,是一个十分有潜力的药物开发先导化合物筛选库。先导化合物是通过各种方法或手段获得的具有某种生物活性的化学结构,能够作为现代新药研发的线索物质。在对其进行进一步的结构改造和修饰后可能获得满足临床使用要求的药品。为了全面了解家蚕羧肽酶和羧肽酶抑制剂,以及家蚕羧肽酶抑制剂是否能够抑制胃癌细胞增殖及其机制,是否有潜力作为先导化合物进行后续药物开发,开展了本研究,包括以下4部分:1.家蚕羧肽酶和羧肽酶抑制剂的鉴定及表达特征分析家蚕和其他生物体一样,体内存在多种蛋白酶和蛋白酶抑制剂参与其生命活动,了解蛋白酶与抑制剂的结构,研究开发蛋白酶与抑制剂在其他领域的功能,能够更好地将其应用于人类生产生活。家蚕羧肽酶和羧肽酶抑制剂此前未见系统报道,基于家蚕基因组测序数据,我们鉴定到家蚕羧肽酶基因家族一共有48个成员,其中34个属于金属羧肽酶（9个M2结构域金属羧肽酶和25个M14结构域金属羧肽酶）,14个属于丝氨酸羧肽酶（5个S10结构域丝氨酸羧肽酶和9个S28结构域丝氨酸羧肽酶）。与多个物种一起构建系统发生树显示,M2结构域金属羧肽酶和M14结构域金属羧肽酶能够明显地分为两簇。M2结构域金属羧肽酶是血管紧张素转换酶,目前在昆虫中功能不明确。M14结构域金属羧肽酶主要在消化食物等过程中发挥功能。此外,S10结构域丝氨酸羧肽酶和S28结构域丝氨酸羧肽酶也明显地分为两簇。丝氨酸羧肽酶在昆虫中被认为可以参与卵黄蛋白降解。分析家蚕基因组数据库芯片数据结合荧光定量PCR显示,家蚕羧肽酶在不同组织中存在差异表达。部分羧肽酶基因在家蚕精巢中高表达,推测可能参与雄性家蚕的生殖发育过程。而另有部分基因则在中肠中高表达,则可能与家蚕消化过程相关。另外的基因在各组织均有表达,我们推测其还可能参与家蚕其他的生理生化活动。随后通过制作并分析雌雄性不同时期芯片发现,在中肠中特异表达的基因均在五龄期表达,在蛹期不表达。在中肠中特异表达的家蚕羧肽酶基因在饥饿刺激后产生了相应的表达差异,表明家蚕羧肽酶基因在中肠中参与消化过程。利用双向电泳和质谱技术,我们首次鉴定到家蚕羧肽酶抑制剂。家蚕羧肽酶抑制剂为一个113个氨基酸组成的,分子量12.5 k Da左右的蛋白,并利用原核表达技术,获得了具有生物活性的家蚕羧肽酶抑制剂重组蛋白,并制备获得抗体。经不同温度或p H环境处理后测定抑制剂活性,我们发现家蚕羧肽酶抑制剂具有很高的热稳定性及酸碱稳定性。通过荧光定量PCR和Western blot,发现家蚕羧肽酶抑制剂在家蚕丝腺中特异高量表达。家蚕羧肽酶抑制剂在丝腺不同区段地表达有明显的时间相关性。五龄中前期,家蚕羧肽酶抑制剂在后部丝腺表达量高,而五龄后期在中前部丝腺表达量高。家蚕羧肽酶抑制剂作为家蚕存在的一种生物活性物质,其稳定的活性是家蚕药用化的重要前提。2.家蚕羧肽酶抑制剂抑制胃癌细胞增殖为了研究家蚕羧肽酶抑制剂是否能够抑制胃癌细胞的增殖,我们选取MKN45,SGC7901和HGC27共三株胃癌细胞系作为实验对象进行培养。在细胞水平,家蚕羧肽酶抑制剂能够显著抑制MKN45和SGC7901胃癌细胞株的生长,并且伴随明显的剂量和时间依赖性。添加10μg/m L家蚕羧肽酶抑制剂后培养胃癌细胞,在第三天其对于胃癌细胞抑制率能达到25%。家蚕羧肽酶抑制剂经不同温度或p H环境处理后测定其抗胃癌细胞活性,发现其经过不同条件处理后均能稳定抑制胃癌细胞增殖。通过平板克隆实验发现,加入家蚕羧肽酶抑制剂使得胃癌细胞系的克隆形成能力降低,克隆大小明显小于对照组。3.家蚕羧肽酶抑制剂通过EGF/EGFR信号通路抑制胃癌细胞增殖肿瘤细胞表皮生长因子受体的自磷酸化是其快速增殖的重要标志。我们通过Western blot发现MKN45和SGC7901都能发生明显的表皮生长因子受体自磷酸化。加入EGF能够显著促进胃癌细胞的增殖速度,而在加入家蚕羧肽酶抑制剂后,这种趋势得到遏制。通过检测与表皮生长因子受体相关的MAPK/ERK通路相关蛋白,发现EGF作为信号通路转导启动者,激活了下游相关蛋白的表达及磷酸化,而加入家蚕羧肽酶抑制剂可以抑制EGF引发的级联反应活性。通过检测MAPK/ERK通路相关的所有蛋白表达情况,我们发现家蚕羧肽酶抑制剂可以下调该通路上蛋白的表达,并且呈剂量依赖性。家蚕羧肽酶抑制剂通过MAPK/ERK通路下调c-Myc的表达,同时过表达c-Myc可以减缓家蚕羧肽酶抑制剂对胃癌细胞的抑制作用,随后我们发现胃癌细胞中CDK2,CDK4,Cyclin D1和Cyclin E1等四个周期蛋白因为家蚕羧肽酶抑制剂地加入而下调表达。以上结果表明家蚕羧肽酶抑制剂通过由EGF/EGFR启动的MAPK/ERK通路抑制原癌基因c-Myc的表达,进而影响相关细胞周期蛋白表达,抑制胃癌细胞增殖。4.探索基于家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段筛选肿瘤先导化合物从天然产物的活性成分中发现先导化合物是现代新药研发的重要来源之一。基于我们的实验结果,探究了基于天然来源蛋白质家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段能否作为肿瘤治疗先导化合物。通过计算机模拟分子对接技术,将家蚕羧肽酶抑制剂与表皮生长因子受体的激酶区域进行了分子对接,结果发现家蚕羧肽酶抑制剂部分肽段与已报道的小分子抑制剂Tak-285在表皮生长因子受体上的作用位置重叠。基于对接结果,我们设计多肽片段进行CCK-8细胞增殖检测实验,发现家蚕羧肽酶抑制剂多肽能够有效抑制胃癌细胞系的增殖。多肽片段同样通过MAPK/ERK通路发挥抑制功能,但抑制效率不如Tak-285小分子,表明该多肽片段仍有进一步优化空间。通过平板克隆实验发现,与对照组细胞形成的克隆相比,加入家蚕羧肽酶抑制剂有效多肽片段后细胞克隆明显变小,数量减少。综上所述,这些研究表明家蚕存在48个羧肽酶和1个羧肽酶抑制剂。这些羧肽酶在中肠参与消化过程,在精巢参与雄性生殖发育过程,不同的羧肽酶在不同时期不同部位均发挥重要功能。羧肽酶抑制剂特异高量存在于家蚕丝腺中。作为一种生物活性成分,家蚕羧肽酶抑制剂能够抑制胃癌细胞的增殖。进一步我们发现家蚕羧肽酶抑制剂是通过EGF/EGFR启动的MAPK/ERK通路抑制原癌基因c-Myc的表达,进而抑制胃癌细胞增殖。c-Myc的异常高表达是预后差的胃癌患者具有的普遍特征,基于家蚕羧肽酶抑制剂能够抑制c-Myc表达这一发现,我们设计家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段作为肿瘤治疗先导化合物,挖掘家蚕羧肽酶抑制剂作为胃癌治疗药物的潜力,为后续临床应用提供线索。