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葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD)系统命名为β-D-葡萄糖：氧化还原酶(EC1.1.3.4)。该酶能够利用氧气将葡萄糖氧化成葡萄糖酸并产生过氧化氢,因而具有除氧、抗氧化、去除葡萄糖以及生成葡萄糖酸的作用,被广泛应用于食品、医药、生物技术等行业。工业生产上多采用黑曲霉或青霉属的菌株发酵制备葡萄糖氧化酶,但是常出现酶活力不高、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因此,可通过基因工程技术构建葡萄糖氧化酶工程菌株,实现该酶的异源高效表达,同时简化纯化过程。本研究以实验室保藏的黑曲霉Aspergillus niger Z-25为出发菌株,克隆到葡萄糖氧化酶基因,并将该基因整合至毕赤酵母Pichia pastoris的染色体基因组上,实现了葡萄糖氧化酶的高效表达。同时,对重组毕赤酵母在摇瓶和发酵罐水平的产酶条件、重组葡萄糖氧化酶的纯化过程以及酶学性质进行了研究。主要内容如下：1.黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析。以黑曲霉菌株Aspergillus niger Z-25的基因组DNA为模板,通过PCR扩增到1818 bp的葡萄糖氧化酶完整开放阅读框,在GenBank数据库中的登录号为FJ979866。序列分析表明,该葡萄糖氧化酶的核苷酸序列与A. niger NRRL-3和A. niger ATCC 9029的葡萄糖氧化酶核苷酸序列(登录号分别为X16061和J05242)相似性达93%,推导的氨基酸序列相似性达97%,共有17个氨基酸残基发生了置换。在编码A. niger Z-25葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中,含有由22个氨基酸残基组成的信号肽和583个氨基酸残基组成的成熟肽,以及3个位于保守位点的半胱氨酸残基(Cys164、Cys206、Cys521)和7个潜在的N-糖基化位点Asn-X-Thr/Ser (Asn89、Asn161、Asnl68、Asn258、Asn355、Asn388、Asn473)。2.黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达。将A.niger Z-25葡萄糖氧化酶基因与毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA连接,构建重组表达载体pPICZaA-GOD。经限制性内切酶Pme I线性化后,电击转化毕赤酵母SMD1168,利用zeocin抗性梯度筛选、PCR鉴定,挑取6株重组酵母单菌落进行诱导培养。通过测定发酵上清液的酶活,最终筛选到一株高效表达葡萄糖氧化酶的重组酵母SMD1168/GOD.3.重组毕赤酵母在摇瓶和发酵罐水平的产酶条件研究。确定重组酵母SMD1168/GOD的摇瓶培养条件为：在YPG培养基中培养菌体至对数生长期(OD约为6.0)后,转入pH 5.0的BMMY培养基中,在30℃、240 rpm条件下诱导,每24 h添加甲醇至终浓度为2.0%。诱导168 h后,葡萄糖氧化酶的活力达40 U/mL左右,是出发菌株A. niger Z-25的20倍。在19 L发酵罐中高密度培养SMD1168/GOD时,控制温度29.5。C、培养基pH 5.5、溶氧25%以上,经过20.5 h的甘油分批阶段和7.5 h的甘油流加阶段后,开始甲醇流加培养。诱导142 h后,重组葡萄糖氧化酶的活力达522.5 U/mL,是摇瓶发酵水平的13倍。4.重组葡萄糖氧化酶的分离纯化和酶学性质研究。重组葡萄糖氧化酶粗酶液经60-90%饱和度的(NH4)2SO4沉淀后,得到电泳纯的葡萄糖氧化酶,比活力为153.46U/mg,回收率达到95.6%,纯化了3.34倍。经SDS-PAGE检测,重组葡萄糖氧化酶亚基的分子量约为94 kDa,糖基化程度为31.9%。重组葡萄糖氧化酶的最适作用温度和pH分别为40℃和6.0,在温度不超过40℃时能保持90%以上的酶活力,在pH值为4.0-8.0的范围内维持稳定。Ag+对重组葡萄糖氧化酶的活性具有明显的促进作用,Cu2+、Pb2+对重组酶的活性具有强烈的抑制作用,Fe3+对酶活有微弱的抑制作用。根据Lineweaver-Burk双倒数法计算得到重组葡萄糖氧化酶的Km和Kcat值分别为16.95mM和484.26 s-1。