【摘 要】
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【目的】糖尿病肾病（DKD）是终末期肾病的主要原因。DKD的发病机制未完全阐明,治疗方法有限。内皮细胞功能紊乱促进DKD的发展。此外,炎症状态在DKD发生和发展中也起着重要的作用。羟苯磺酸钙（CaD）有改善活性氧激活的内皮通透性升高、增强内皮细胞一氧化氮合酶活性、抗凋亡、抑制炎症因子的作用。广泛用于糖尿病视网膜病。糖尿病肾脏病变和视网膜病变发病机制有类似之处。而CaD治疗DKD的研究较少。本研究拟
【基金项目】
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国家自然科学基金（81370794,81570604）； 上海市综合医院中西医结合专项（ZHYY-ZXYJHZX-1-02）；
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【目的】糖尿病肾病（DKD）是终末期肾病的主要原因。DKD的发病机制未完全阐明,治疗方法有限。内皮细胞功能紊乱促进DKD的发展。此外,炎症状态在DKD发生和发展中也起着重要的作用。羟苯磺酸钙（CaD）有改善活性氧激活的内皮通透性升高、增强内皮细胞一氧化氮合酶活性、抗凋亡、抑制炎症因子的作用。广泛用于糖尿病视网膜病。糖尿病肾脏病变和视网膜病变发病机制有类似之处。而CaD治疗DKD的研究较少。本研究拟通过体内、体外和临床研究探讨CaD对DKD的治疗作用、安全性,及其对高血糖导致的肾脏内皮功能紊乱和炎症的保护作用。【方法】1)脐静脉内皮细胞（HUVEC）根据不同糖和渗透压浓度分组;再根据不同CaD浓度分组（CaD 25uM、50uM、100uM）并设不同时间点（24、48、72小时）。db/db小鼠分两组:对照组（生理盐水灌胃）、用药组（CaD 100mg/kg灌胃）;db/m小鼠作为对照。Westernblot和real-time PCR检测HUVEC和小鼠VEGF、VEGFR、ET-1、p-eNOS/eNOS、PTX3、MCP-1、ICAM。CCK8检测细胞增殖。Transwell小室测定细胞迁移。FITC-BSA测定细胞通透性。流式细胞术测定细胞凋亡。ELISA方法检测小鼠血清胱抑素C。HE、PAS染色观察小鼠肾组织损伤情况;TUNEL染色观察小鼠肾组织细胞凋亡;免疫荧光染色观察小鼠肾脏p-eNOS表达;免疫组化染色观察CD34、VEGF、PTX3表达。2)①TPCA-1阻断HUVEC的NF-κB通路。②siRNA-PTX3干预实验。Westernblot测PTX3、p-eNOS/eNOS。流式细胞术测定细胞凋亡。③腺病毒包裹siRNA-PTX3干预db/db小鼠实验。小鼠分为:db/m组、db/m+腺病毒组、db/db组、db/db+腺病毒组。ELISA方法检测小鼠血清胱抑素C。HE、PAS染色观察小鼠肾组织损伤情况;TUNEL染色观察小鼠肾组织细胞凋亡;免疫荧光染色观察小鼠肾脏p-eNOS表达;免疫组化染色观察p-IKBa、PTX3、P65表达。3)采用横断面研究方法,观察DKD患者与糖尿病无蛋白尿患者以及健康人群间,内皮相关标志物和炎症相关标志物的区别。前瞻性随机对照研究,选取DKD患者。入组患者随机分成用药组（口服羟苯磺酸钙,每次500mg,每天3次）和观察组。3个月后,收集临床资料、相关生化指标。并检测VEGF、ET-1、eNOS、NO、MCP-1、ICAM、PTX3。【结果】1)高糖引起HUVEC中VEGF、VEGFR、ET-1、ICAM、MCP-1、PTX3表达增加,p-eNOS/eNOS表达降低。CaD改善高糖引起内皮细胞异常增殖、迁移力增高、通透性增高、内皮细胞凋亡、内皮细胞功能紊乱和炎症状态。CaD改善db/db小鼠肾内血管增殖、肾脏内皮功能紊乱和炎症状态、细胞凋亡,从而减少db/db小鼠24小时尿白蛋白,保护肾功能。2)CaD改善高糖引起HUVEC中PTX3、p-IKBa/IKBa表达增加,p-eNOS/eNOS表达降低。用TPCA-1阻断NFκB信号通路后,高糖引起的高PTX3表达下降,而降低的p-eNOS/eNOS表达升高,呈剂量依赖。沉默PTX3基因后p-eNOS/eNOS表达增加。沉默PTX3基因可减少高糖引起的内皮细胞凋亡。CaD降低db/db小鼠肾内PTX3、p-IKBa/IKBa、P65表达,增加p-eNOS/eNOS的表达。沉默PTX3基因后,db/db小鼠的尿蛋白和肾功能得到改善;肾小球细胞外基质减少;p-eNOS/eNOS表达升高;肾脏内细胞凋亡减少。3)横断面研究,PTX3、NO、HbAlc是DKD的影响因素。前瞻性研究,DKD患者服用CaD后,24小时尿微量白蛋白、24小时尿总蛋白显著下降;基于胱抑素C的GFR没有显著改变。用药后,患者内皮和炎症标志物较前有显著改善。【结论】提示CaD可能通过调整IKK/IKB/NF-κB通路,抑制PTX3的表达,从而改善内皮细胞功能,保护肾功能。CaD通过改善DKD患者的微炎症状态和内皮功能来减少尿蛋白、保护肾脏,在DKD治疗中有一定的应用前景。而PTX3也可能是治疗DKD的潜在治疗靶点。
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