GSTpi通过激活ATM信号通路促进MMS诱导的293T细胞DNA损伤修复

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背景与目的:细胞在内源性因素和外界环境的刺激下会产生成千上万的DNA损伤位点。如果DNA损伤得不到及时修复,将会严重威胁到细胞正常生理功能。因此,细胞进化出了复杂的DNA损伤应答网络,从而保证遗传信息的准确传递。DNA损伤应答网络主要包括DNA损伤修复系统和DNA损伤检查点,前者通过迅速感应损伤DNA并起始损伤修复,后者通过减慢或停滞细胞周期给予DNA损伤细胞充足的修复时间。GSTpi是谷胱甘肽S-转移酶家族的重要成员,与机体抗氧化、有毒化合物代谢、信号转导等多种生理过程密切相关。方法与结果:本研究中,我们选用MMS建立体外培养293T细胞的DNA损伤模型,通过CCK8和免疫印迹实验确定了MMS染毒条件:0.5m M,1h。结果表明,经MMS染毒后,细胞内GSTpi含量先上升后下降,在撤药后12h时GSTpi达到峰值,撤药后48h时恢复本底水平。核质分离实验结果表明,正常状态下细胞核内GSTpi含量很低,而经MMS染毒后细胞核内GSTpi含量显著上升。为了揭示DNA损伤后GSTpi核转移的生理意义,我们通过免疫印迹、免疫荧光、单细胞凝胶电泳实验,比较了空白对照组、转染pc DNA3.1组、转染GSTpi组细胞DNA损伤及修复情况。结果显示,过表达GSTpi显著增强了细胞DNA损伤修复能力。机制研究发现,过表达GSTpi组经MMS染毒后,细胞内p-ATM、p-Chk2、p-p53水平显著高于阴性对照组,表明GSTpi能够促进ATM-Chk2-p53信号通路活化,提高细胞DNA损伤修复效率。此外,我们借助p-ATM抑制剂Ku55933和p53抑制剂Pifithrin-α进一步实验验证了上述结果。最后,利用流式细胞分析仪检测细胞周期,发现过表达GSTpi组细胞G2/M期所占比例显著高于阴性对照组,而p53抑制剂Pifithrin-α预先孵育能够显著抑制G2/M期细胞周期阻滞。上述结果表明GSTpi诱导细胞发生G2/M期细胞周期阻滞,依赖于ATM-Chk2-p53信号通路的活化。结论:在MMS诱导建立的293T细胞DNA损伤模型中,GSTpi通过促进ATMChk2-p53信号通路活化,使细胞发生G2/M期细胞周期阻滞,从而增强细胞DNA损伤修复能力,使细胞在充足时间内进行DNA损伤修复,有效避免了错误遗传信息的传递。本文从细胞DNA损伤修复方面,阐述了GSTpi对DNA损伤细胞的保护作用及其分子机制。研究结果对高表达GSTpi肿瘤细胞多药耐药的治疗具有一定借鉴意义。
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