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真菌细胞壁是位于细胞质膜外的动态超分子结构,是真菌细胞的天然保护屏障,参与细胞的生长、分裂及形态发生等重要过程。在担子菌的子实体生长过程中,其菌柄可在短时间内迅速增长,这一过程主要依靠细胞壁的重构使细胞得以伸长生长,而并非是细胞的分裂作用。在细胞壁重构过程中,细胞壁不仅要提供足够的刚性结构以维持细胞形状,也要具有一定可塑性使细胞壁得以扩张,其中涉及自身细胞壁组分的系列变化,如部分水解旧细胞壁组分、合成新细胞壁组分以及新细胞壁组分在一系列酶的帮助下交联到胞质及细胞壁空间中。真菌细胞壁基本骨架主要由几丁质微纤维和葡聚糖链共价交联而成,在细胞壁扩张中,相关水解酶如葡聚糖酶和几丁质酶可以对细胞壁组分进行降解和重构,其中几丁质酶是参与细胞壁降解和重构的重要酶类。我们实验室前期研究发现,几丁质酶主要参与几丁质微丝的部分水解,使细胞壁松弛,在细胞膨压作用下扩大细胞壁空间,利于新细胞壁组分的加入从而使细胞壁得以扩张。为研究几丁质酶在灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）子实体菌柄细胞壁伸长生长中的作用,本文对灰盖鬼伞中两种几丁质酶进行了重组表达和相关酶学性质的研究,以便为真菌细胞壁扩张机制研究提供基础。为获取几丁质酶Chi En2,我们首先构建了含Chi En2基因的重组表达质粒,接着利用毕赤酵母（Pichia pastoris）真核表达系统对Chi En2进行异源重组表达,发酵液上清通过镍柱亲和层析分离并纯化得到Chi En2蛋白,最终通过质谱鉴定确认该重组表达蛋白即为几丁质酶Chi En2,并对其酶学性质进行了重点研究。对几丁质酶Chi En2的底物特异性研究发现该酶最适底物为85%脱乙酰基壳聚糖,不能水解不溶性底物几丁质粉末和胶态几丁质,但该酶可协同Chi E1和ChiⅢ水解胶态几丁质。当在底物中同时加入Chi E1和Chi En2时,其对几丁质粉末无协同水解作用,但对胶态几丁质的水解活性比单独加入这两种酶提高了78.1%。当在底物中同时加入Chi III和Chi En2时,其对几丁质粉末也无协同水解作用,但对胶态几丁质的水解活性比单独用这两种酶作用提高了124%。Chi En2最适p H为7.0,水解反应的最适温度为40℃,以85%脱乙酰基壳聚糖为底物的反应动力学参数为Km=0.25 mg m L-1,Kcat=2.37 S-1,Vmax=2.86μmol min-1 mg protein-1,Chi En2不是金属酶。Chi En2在Gene Bank中被注释为GH 18家族的内切几丁质酶,该酶对（Glc NAc）2-3-p NP的水解活性发现Chi En2对（Glc NAc）2-p NP的水解活性约是对（Glc NAc）3-p NP的5倍,推测该酶具有外切几丁质酶活性。Chi En2对（Glc NAc）2-6的水解产物经HAPEC-PAD分析,发现Chi En2水解（Glc NAc）5的产物主要为（Glc NAc）3,Chi En2以（Glc NAc）6为底物进行水解时生成两个（Glc NAc）3或者一个（Glc NAc）4和一个（Glc NAc）2,同时发生转糖基产生（Glc NAc）8,推测该酶具有内切几丁质酶活性。几丁质寡糖可在Chi En2的作用下通过转糖基生成更大的寡糖。先前报道的灰盖鬼伞中几丁质酶大多只能从底物的非还原端开始水解,而Chi En2可从底物的还原末端或非还原末端开始水解。通过对Chi En2水解（Glc NAc）3-6产物进行异头体构型分析发现Chi En2水解（Glc NAc）5产生的（Glc NAc）2和（Glc NAc）3分别含82.8%的β异头体和48.2%的β异头体,说明Chi En2可以从（Glc NAc）5底物的还原端和非还原端同时水解释放（Glc NAc）2和（Glc NAc）3。Chi En2的蛋白质三维结构预测结果显示Chi En2底物结合沟槽接近两端处具有明显的小的氨基酸环状结构（Ile150与Tyr298,Trp41与Asp312）可能会阻碍蛋白与不溶性底物之间的结合。同样,为获取几丁质酶Chi En4,我们构建了含Chi En4基因的重组表达质粒并利用毕赤酵母真核表达系统对Chi En4进行异源重组表达。但在分离纯化过程中无法通过镍柱亲和层析的方法得到Chi En4蛋白,我们推测蛋白表达后期可能发生了折叠而将组蛋白标签包裹在内部从而无法与镍离子结合。采用硫酸铵沉淀法浓缩分泌蛋白,经初步测定确认该蛋白具有几丁质酶活性。我们通过蛋白质免疫印迹法和质谱鉴定确认该重组表达蛋白即为几丁质酶Chi En4,并对其酶学性质进行了初步研究。Chi En4同样在Gene Bank中被注释为GH18家族的内切几丁质酶。Chi En4最适底物为85%脱乙酰基壳聚糖,Chi En4不能水解几丁质粉末和胶态几丁质,但能协同ChiⅢ水解胶态几丁质并显著增强酶活。根据对Chi En4蛋白三维结构预测推测在其表面的底物结合沟槽处由Y262与L116组成的氨基酸环状结构可能阻碍蛋白与不溶性底物的结合。由于未得到Chi En4纯酶,目前对其酶学性质的研究还不完善,有待通过重新表达或利用其他分离纯化方法获取纯酶以做进一步研究。本项研究进一步揭示了灰盖鬼伞存在一类特殊的几丁质酶,它们不能水解不溶性的几丁质,只能水解可溶性的几丁质衍生物或几丁质寡糖,这类酶在结构上都具有一个显著的特点,其底物结合槽被部分氨基酸凸起所遮蔽,形成空间阻隔,使几丁质链不能有效接触到酶底物结合位点上。其作用主要是协同能水解不溶性几丁质底物的几丁质酶的降解作用。