粟酒裂殖酵母中Trz2影响线粒体tRNA半分子的加工及参与铁依赖的细胞凋亡机制的研究

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线粒体是绝大多数真核生物产生能量的主要场所。线粒体参与许多重要的生理过程,包括铁硫簇和血红素的生物合成、细胞凋亡、细胞自噬。线粒体的功能与人类健康密切相关,细胞线粒体功能紊乱可导致癌症、神经退行性病变甚至肌肉萎缩等疾病。线粒体是一种半自主性细胞器,有其自身编码的DNA(mt DNA)。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的mt DNA编码氧化磷酸化复合物的7个关键亚基、两个r RNA、25个t RNAs,以及线粒体核糖体蛋白小亚基蛋白Var1和RNase P的催化RNA—rnp B。细胞内的RNA除了mRNA、rRNA和tRNA外,还存在非编码RNA(non-coding RNA)。t RNA半分子(t RNA halves)是一类来源于t RNA的非编码RNA。在一些特定情况下,也会产生一类小片段RNA分子—t RFs(t RNA-derived fragment,t RFs)。细胞质中的t RNA半分子与应激有关,但是有关线粒体t RNA半分子的研究较少。在之前的研究中,通过分析转录组数据发现粟酒裂殖酵母线粒体中存在一些未被描述过的t RNA半分子、t RFs。本课题分析了粟酒裂殖酵母线粒体中6个t RNA半分子可能的切割位点,并运用Northern blot进行了验证。线粒体内3个t RNA存在5’t RNA半分子,3个t RNA存在3’t RNA半分子,同时t RNAAsn(GUU)还存在5’t RFs。其次还发现在高温刺激条件下和进入稳态期时t RNA半分子会增多。Trz2是线粒体中t RNA 3’末端加工酶,Trz2失活后影响了5’t RNAGln(CAG)和3’t RNASer(GCU)来源的t RNA片段的产生。本研究又采取高表达的方法研究Trz2的功能,前期结果表明高表达Trz2引起的细胞凋亡并不依赖于caspase激活途径,具体作用机制需要进一步解析。线粒体脱氧核糖核酸酶Pnu1在异常情况下通过降解核DNA导致核DNA碎片化引发细胞死亡。本研究构建了高表达Trz2的Pnu1缺失菌株(p REP3X-trz2/Δpnu1),通过点圈实验发现高表达Trz2引起的细胞凋亡现象依旧存在。BPS-Fe比色法和原子吸收光谱法证实高表达Trz2菌株细胞内的铁水平明显高于野生型菌株(p REP3X/y AS56)(P<0.05)。在添加了铁离子螯合剂BPS培养后,高表达Trz2菌株(p REP3X-trz2/y AS56)的细胞存活率提高且细胞凋亡性特征消失。另一方面,q RT-PCR结果表明高表达Trz2菌株中与铁转运相关的基因(shu1,frp1,fio1,fip1,str1,str2,str3)表达量显著上调。这些数据表明高表达Trz2后,细胞内的铁稳态被打乱,导致线粒体功能紊乱从而引发凋亡。本研究为了解t RNase ZL及线粒体相关疾病的发生机制提供新的思路,并为今后利用裂殖酵母为模型筛选治疗相关疾病药物打下扎实的基础。
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