【摘 要】
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三七是我国宝贵的中药资源,其根、茎、叶等部位均可入药,皂苷类是其发挥药用作用的主要成分。本工作对三七根、三七叶提取物进行生物转化与分离纯化研究,将其中含量较高的皂苷Rb1、Rd、Fd等用微生物酶法转化成药效高的稀有皂苷F1、CK等,并对转化酶进行分离纯化。(1)用HPLC与LC-MS对三七根、三七叶提取物中的皂苷成分及转化产物稀有皂苷进行鉴定。从本课题组保藏的菌株中筛选了能够特异性转化三七根、三七
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三七是我国宝贵的中药资源,其根、茎、叶等部位均可入药,皂苷类是其发挥药用作用的主要成分。本工作对三七根、三七叶提取物进行生物转化与分离纯化研究,将其中含量较高的皂苷Rb1、Rd、Fd等用微生物酶法转化成药效高的稀有皂苷F1、CK等,并对转化酶进行分离纯化。(1)用HPLC与LC-MS对三七根、三七叶提取物中的皂苷成分及转化产物稀有皂苷进行鉴定。从本课题组保藏的菌株中筛选了能够特异性转化三七根、三七叶提取物中常量皂苷为稀有皂苷F1、CK和ⅩⅢ的黑曲霉。(2)对黑曲霉酶液转化三七根提取物为稀有皂苷F1、CK的影响因素:转化温度、pH、酶浓度、菌培养时间进行了研究,结果表明:黑曲霉固体曲培养4 d后浸提酶液,在最适条件下转化三七根提取物(1%)72 h,皂苷R1、Re、Rg1转化率分别为88.6%、91.0%、71.8%,F1浓度为2.82 mg/mL,得率为84.7%.黑曲霉固体曲培养5 d后浸提酶液,在最适条件下转化三七根提取物(1%)72 h,皂苷Rb1转化率为99.8%,皂苷Rd转化率为84.3%,在转化0.5 h时Rd浓度最高为3.16 mg/mL(0.5 h为获得最大量Rd的最适转化时间),皂苷F2在转化6h时浓度最高(1.69 mg/mL,为获得最大量F2的最适转化时间),在转化72 h时,皂苷CK浓度为2.91 mg/mL,得率为85.8%.(3)对黑曲霉酶液转化三七叶提取物为皂苷ⅩⅢ、CK的的影响因素:转化温度、pH、酶浓度、菌培养时间进行了研究。结果表明:黑曲霉固体曲培养5 d后浸提酶液,在最适条件下转化三七叶提取物(2%)108 h,皂苷Fe转化率为86.7%,转化产物中Mc浓度为1.64 mg/mL,得率为81.9%;皂苷Fd转化率为89.0%,转化产物ⅩⅢ浓度为2.80 mg/mL,得率为81.3%.本工作为首次从三七叶提取物原料中制得皂苷ⅩⅢ。(4)对大孔吸附树脂的静态吸附和解吸附实验表明:大孔树脂D302对皂苷F1、CK、ⅩⅢ的分离效果较好。经大孔树脂纯化后,20 g三七根提取物可得到皂苷F1 3.88 g,回收率69.5%;可得到皂苷CK 3.94 g,回收率68.4%;20 g三七叶提取物可得到皂苷ⅩⅢ 2.01 g,回收率73.9%;可得皂苷CK 1.64 g,回收率 69.2%.(5)利用盐析对黑曲霉酶蛋白进行分离纯化,结合文献判断转化产生皂苷F1的酶蛋白为人参皂苷Ⅳ型酶,产生皂苷CK的酶蛋白为人参皂苷Ⅰ型酶,产生皂苷ⅩⅢ的酶为人参皂苷Ⅱ型酶。
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