论文部分内容阅读
目的:建立大鼠HIRI模型,观察氧化应激、Hcy及相关代谢酶在HIRI中的变化,以及肝龙胶囊对HIRI预处理的作用,为后续的研究奠定基础。方法:1、将60只SD大鼠随机分为Sham组、HI组和HIR组,其中HIR组设置4个再灌注时间段,包括HIR3 h组、HIR6 h组、HIR12 h及HIR24 h组,每组10只。建立大鼠HIRI模型,观察大鼠的生存情况与状态,肝组织HE染色观察病理学,确定大鼠HIRI模型建立情况。2、检测大鼠HIRI模型中血浆AST、ALT活力和肝组织的HA、LN含量,以及实时荧光定量PCR测定肝组织OPN、α-SMA mRNA表达水平,观察大鼠肝脏损伤情况。3、检测大鼠HIRI模型肝组织中XOD、GSH-Px、CAT、NOS及SOD的活力,和GSH、NO、MDA的含量,来验证氧化应激反应参与HIRI的发生。4、检测大鼠HIRI模型肝组织中Hcy的含量,实时荧光定量PCR测定大鼠肝组织MS、CβS、MTHFR、BHMT及ER-αmRNA的表达水平,评价Hcy及代谢、ER-α在HIRI中的作用。5、将40只SPF级SD大鼠随机分为5组,即正常对照组、模型组、肝龙胶囊（GL）低、中、高剂量组(60、120、240 mg·kg-1),每组8只。各组大鼠按1m L·100 g-1的给药容积灌胃相应剂量的药物或生理盐水,1次/d,持续14 d。末次给药结束后各组进行相应操作,并观察肝组织HE染色病理学变化,检测血浆中AST、ALT活力,测定肝组织中MDA、Hcy、HA、LN含量和XOD、SOD活力,来评价肝龙胶囊对大鼠肝脏缺血预处理的作用。结果:1、通过半肝血流阻断法阻断大鼠肝左叶和中叶的血供,使大鼠肝脏约70%肝组织缺血90 min后再灌注血流建立HIRI的模型成功诱导肝损伤,且建模动物存活率达83.3%。与Sham组和HI组比较,HIR组大鼠肝脏脏器系数的差异均无统计学意义（P>0.05）。2、HE染色结果显示,Sham组镜下可观察到肝组织汇管区及中央静脉结构正常完整,肝细胞呈索状排列整齐,大小均匀,形态正常,无变性和坏死,肝窦明显扩张;HI组肝细胞索状排列不整齐,分布不均匀,有少量变性和坏死,肝窦被挤压变形且有明显淤血,有较少炎性细胞浸润;HIR3 h组和HIR6 h组肝细胞排列不齐且不均匀,有少量变性与坏死,肝窦挤压变形且有大量红细胞滞留,有少量炎性细胞浸润;HIR12 h组和HIR24 h组肝细胞排列不整齐且分布均匀,大小不均匀,有不同程度变性、水肿与坏死,肝窦被挤压变形甚至消失且有红细胞淤滞。HIR组的肝组织损伤以HIR24 h组最为严重,其肝细胞出现水肿和局灶坏死,且有大量炎性细胞浸润。3、与Sham组和HI组比较,大鼠肝脏缺血且再灌注一定时间后,HIR组肝组织中XOD活力和NO、MDA含量均有不同程度上升,其中以HIR24 h组的升高最明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,而GSH含量和GSH-Px、NOS、CAT及SOD活力不同程度下降,以HIR6 h组和HIR12 h组的下降最明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Sham组比较,HI组肝组织中SOD、GSH-Px活力下降,差异明显且有统计学意义（P<0.01）,而GSH、NO、MDA含量和XOD、CAT、NOS活力的变化差异无统计学意义（P>0.05）。4、与Sham组比较,HI组和HIR组大鼠血浆AST和ALT的活力均有不同程度的显著升高,差异均有统计学意义（P<0.01）,尤其以HIR6 h组和HIR12 h组两组活力的升高最明显;与HI组比较,HIR3 h、HIR6 h和HIR12 h组大鼠血浆的AST活力和HIR组大鼠血浆的ALT活力均有不同程度升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。与Sham组和HI组比较,HIR12 h组及HIR24 h组大鼠肝组织HA、LN含量均明显升高,差异明显且具有统计学意义（P<0.01）。5、RT-q PCR结果显示,与Sham组和HI组比较,HIR6 h组、HIR12 h组和HIR24 h组大鼠肝组织OPN mRNA的表达量均不同程度显著增高,HIR组大鼠肝组织α-SMA mRNA的表达量也均不同程度显著增加,其中OPN、α-SMA mRNA的表达量增高以HIR24 h组明显,差异明显,有统计学意义（P<0.01）。HI组大鼠肝组织α-SMA和OPN mRNA的表达量较Sham组亦有增加,但差异没有统计学意义（P>0.05）。6、与Sham组和HI组比较,HIR12 h组和HIR24 h组大鼠肝组织中Hcy含量均显著升高,其中HIR24 h组含量最高,差异明显,具有统计学意义（P<0.01）。HI组大鼠肝组织中Hcy含量较Sham组升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与Sham组比较,HI组和HIR组大鼠肝组织的MS mRNA表达量均不同程度降低,CβS mRNA的表达量均增加;HIR6 h组、HIR12 h组及HIR24 h组大鼠肝组织MTHFR mRNA的表达量和HIR组大鼠肝组织的BHMT mRNA的表达量均有不同程度增加,差异均具有统计学意义（P<0.05）。其中MS mRNA的表达量在再灌注12 h时降低最明显,CβS与MTHFR mRNA的表达量在再灌注24 h时增高最显著,BHMT mRNA的表达量在再灌注6 h时增高最为明显。与HI组比较,HIR3 h组、HIR6 h组及HIR12 h组组大鼠肝组织的MS mRNA表达量均降低,而HIR24h组MS mRNA表达量增加,差异明显,有统计学意义（P<0.01）;HIR24 h组大鼠肝组织CβS mRNA的表达量显著增加,差异明显,有统计学意义（P<0.01）;HIR组大鼠肝组织MTHFR与BHMT mRNA的表达量增加,但差异无统计学意义（P>0.05）。7、研究结果发现,与模型组比较,大鼠在不同浓度的肝龙胶囊预处理后,肝组织病理形态均有不同程度改善;GL中剂量组大鼠血浆AST、ALT的活力明显降低（P<0.01）;GL低、中、高剂量组大鼠肝组织SOD活力不同程度升高（P<0.05）,MDA含量降低（P<0.05）,GL中、高剂量组大鼠肝组织活力和Hcy含量显著降低（P<0.01）;给药组大鼠肝组织HA、LN含量仅有GL中剂量组的下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1、大鼠肝脏缺血-再灌注能引起肝脏损伤,再灌注加剧肝脏的损伤。2、验证了氧化应激参与HIRI的发生,其中初步将Hcy与HIRI联系研究发现,Hcy可能通过自身氧化产生大量活性氧损伤肝组织。4、HIRI导致MS基因表达异常,使Hcy甲基化径的代谢紊乱,导致Hcy在体内蓄积。5、一定剂量的肝龙胶囊对大鼠HIRI预处理具有保护肝脏作用,可能通过减轻Hcy的自身氧化作用和减少ROS的产生,以及提高抗氧化作用,减轻肝细胞的损伤。