中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹、毛蟹,是我国重要的淡水养殖品种,具有很高的经济价值。但是,由于养殖规模的不断扩大,其病害也越来越严重,其中“颤抖病”作为中华绒螯蟹最严重的病害之一,已经对其养殖业造成了严重的经济损失。王文等通过前期的研究证实了螺原体为中华绒螯蟹“颤抖病”的病原体,并命名为中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)。前期研究表明,中华绒螯蟹螺原体通过鳃或表皮进入体内,侵染其靶细胞—血淋巴细胞,并通过血液循环进而侵染结缔、神经等组织引起中华绒螯蟹附肢颤抖。Tetraspanin属于四次跨膜蛋白超家族(TM4SF),参与基本的细胞过程,包括细胞生长、粘附和分化,参与识别某些病原体的感染,在免疫反应中发挥着重要的作用。本课题组前期利用iTraq技术筛选了中华绒螯蟹螺原体侵染前后中华绒螯蟹血淋巴细胞中差异表达的蛋白,其中Tetraspanin在中华绒螯蟹螺原体感染后表达量显著降低。本硕士论文在此研究基础上通过RACE技术扩增得到了中华绒螯蟹Tetraspanin(EsTetraspanin)基因的全长,进而分析了其序列特征、表达模式。其次,通过蛋白表达、抗体封闭、基因干扰以及果蝇S2细胞过表达等实验研究了其在中华绒螯蟹螺原体侵染过程中的作用。本论文为中华绒螯蟹螺原体侵染机理以及宿主免疫防御机制的深入研究奠定了良好的基础,本研究主要从以下三个方面展开:1.EsTetraspanin序列特征、蛋白表达、抗体制备及相关功能研究本部分以中华绒螯蟹血淋巴细胞的cDNA为模板,通过RACE技术扩增了中华绒螯蟹Tetraspanin基因并命名为EsTetraspanin。序列分析显示EsTetraspanin含有LEL及SEL结构域,并且含有多个棕榈酰化位点。半定量PCR以及qRTPCR结果显示EsTetraspanin在血淋巴细胞中的表达量最高。中华绒螯蟹螺原体刺激后EsTetraspanin在血淋巴细胞中的表达量显著下调,说明EsTetraspanin在中华绒螯蟹螺原体侵染中华绒螯蟹过程中起着重要的作用。此外体外原核表达了EsTetraspanin的LEL结构域并制备了多克隆抗体,为进一步研究EsTetraspanin的免疫功能奠定了基础。2.LEL重组蛋白及多克隆抗体的功能研究重组蛋白rLEL能够与中华绒螯蟹螺原体在体外结合,为进一步研究该重组蛋白在中华绒螯蟹螺原体侵染过程中的功能奠定了基础。将rLEL与中华绒螯蟹螺原体共同注射中华绒螯蟹后,血淋巴细胞中的中华绒螯蟹螺原体拷贝数显著减少,同时中华绒螯蟹的死亡率也明显降低。表明rLEL能够减弱中华绒螯蟹螺原体的侵染活性。利用多克隆抗体对血淋巴细胞进行免疫印迹,激光共聚焦显微镜观察到EsTetraspanin主要分布在血淋巴细胞的表面。此外,将血淋巴细胞用EsTetraspanin多克隆抗体封闭后细胞中的中华绒螯蟹螺原体拷贝数显著增加,表明抗体封闭后加快了中华绒螯蟹螺原体对血淋巴细胞的侵染。这些结果表明EsTetraspanin在中华绒螯蟹先天免疫中发挥着重要的作用。3.EsTetraspanin RNA干扰本实验利用人工转录合成的dsRNA将EsTetraspanin基因成功沉默后,qRTPCR检测到参与中华绒螯蟹先天免疫的多种抗菌肽基因(ALF1、ALF2、ALF3、crustin1)的表达量都显著下调。EsTetraspanin基因沉默后再用中华绒螯蟹螺原体侵染中华绒螯蟹,结果显示将该基因沉默掉后血淋巴细胞中的中华绒螯蟹螺原体拷贝数与对照组相比显著增多,同时中华绒螯蟹的死亡率与对照组相比也显著升高。这进一步说明沉默EsTetraspanin后降低了中华绒螯蟹的免疫力,促进中华绒螯蟹螺原体的感染。4.EsTetraspanin果蝇S2细胞过表达构建了pAc5.1-EsTetraspanin-GFP昆虫细胞表达载体,转入果蝇S2细胞24h后,Western blot检测显示在54 kDa处有明显的条带。激光共聚焦显微镜观察到EsTetraspanin主要表达在果蝇S2细胞的表面。成功过表达后再用中华绒螯蟹螺原体侵染果蝇S2细胞,与对照组相比中华绒螯蟹螺原体拷贝数在EsTetraspanin过表达组显著减少,并且CCK-8细胞活力检测结果显示EsTetraspanin过表达组细胞活力明显升高。此外还利用中华绒螯蟹螺原体多克隆抗体对EsTetraspanin过表达后果蝇S2细胞中的中华绒螯蟹螺原体进行了免疫印迹,激光共聚焦显微镜结果显示EsTetraspanin过表达后果蝇S2细胞中的中华绒螯蟹螺原体数目明显减少。这些结果都表明EsTetraspanin增加宿主对抗中华绒螯蟹螺原体侵染的能力。