论文部分内容阅读
本研究主要以中国李(Prunus salicina)和中国樱桃(P. pseudocerasus)的‘南京垂丝’及其自交后代为材料,首先鉴定了其自交不亲和性或自交亲和性,进而鉴定花粉和雌蕊S特异性识别决定因子,以及部分品种的S基因型,在此基础上开展了其自交不亲和性或自交亲和性机制的研究,取得主要结果如下：一、首先对中国李花粉悬浮剂进行筛选,进而调查了30个品种的花粉量(粒/花朵)和花粉萌发率,最后采用软件SAS8.2对实验数据进行了平均距离法聚类分析和判别分析,并计算花粉量、萌发率分级临界值。结果表明,中国李具有可育的雄配子体(花粉粒),10%葡萄糖溶液是中国李比较合适的花粉悬浮剂。从试验品种间的花朵花粉量来看,最高为’Redgold’(37,169粒/花朵),最低为‘三华李2号’(4,720粒/花朵),可分为4类：Ⅰ类品种占16.7%,花粉量≥32362粒/花朵；Ⅱ类品种占30.0%,花粉量处于32,361～22,556粒/花朵；Ⅲ类品种占46.7%,花粉量处于22,555～9,559粒/花朵；Ⅳ类品种占6.6%,花粉量≤9,558粒/花朵。从品种间的花粉萌发率来看,最高为品系‘82-1-109’(89%),最低为品系‘84-21-62’(9%),可分为4类：Ⅰ类品种占13.3%,花粉萌发率≥76%；Ⅱ类品种占33.3%,花粉萌发率处于75～52%；Ⅲ类品种占36.7%,花粉萌发率处于51～25%；Ⅳ类品种占16.7%,花粉萌发率≤24%。二、对中国李32个品种进行了自然自交授粉,5个品种进行人工自交授粉,16个组合进行人工杂交授粉,采取花柱固定、苯胺蓝荧光染色后用荧光显微镜观察了人工授粉72 h后花柱内花粉管生长情况,并在人工授粉后不同时期进行了坐果率统计。实验结果表明,所有品种经人工自交授粉与自然自交授粉后,在果实采收期的坐果率均为0,表现出自交不亲和性；“盖县大李×芙蓉李”的杂交组合,在果实采收期的坐果率为0,表现为杂交不亲和性；“盖县大李×黄皮李”和“金砂李×油柰”的杂交组合,在果实采收期的坐果率分别为3.15%和4.67%,表现为弱的杂交不亲和性；其余13个组合,在果实采收期的坐果率处于7.76-22.90%,表现为杂交亲和性；授粉72 h后,杂交不亲和组合的花粉管与自交的一样,在花柱中上部生长受到抑制,而杂交亲和组合的花粉管可生长到花柱基部。以上实验结果表明中国李属于典型的配子体型自交不亲和性果树。人工授粉后不同时期统计坐果率,结果表明,中国李由于自交不亲和性引起的落果,可以持续到授粉后40天左右。三、采用李属雌蕊S-RNase基因特异性保守引物进行PCR和RT-PCR,并对扩增产物进行克隆、测序和序列比对,在中国的10个传统李品种中获得了8个符合雌蕊S特异性识别决定因子必要条件的新基因,分别被命名为中国李S-RNase-7～S-RNase-14(基因库登录号分别为AY71290、AY902455、AY996051、DQ003310、DQ512908、DQ512909、DQ512910和EF177345),同时鉴定了中国李25个品种的S-RNases基因型。在中国的传统李品种中鉴定出了更丰富的S-RNase基因多态性。在授粉后,完全亲和性杂交组合的坐果率不一定比半亲和性杂交组合的高。中国李S-RNase-h在本研究样本中表现最高的基因频率,预示着该基因可能与某些优良农艺性状有连锁关系。四、在中国李上鉴定了8个与李属其它物种SFB基因的序列相似性处于76%(中国李的SFB-c与杏的SFB-2)到87%(中国李的SFB-7与梅的SFB-1)之间,并被命名为PsSFB (Prunus salicina S-haplotype-specific F-box gene)(基因库登录号分别是DQ849084、DQ849085、DQ849086、DQ849087、DQ849088、DQ849089和DQ849090)。它们具有与李属其它物种SFB基因相似的结构特征,表现高度的s单元型特异多态性,在花粉中特异性表达。3个包含PsSFBs和S-RNases基因的基因组片段也被成功扩增,它们的物理距离约为410 bp-2,800 bp。这些研究结果表明PsSFBs基因就是中国李GSI的花粉S特异性识别决定因子。五、以表现自交亲和性的中国樱桃(Prunus pseudocerasus)的‘南京垂丝’及其157个自交后代为材料,开展了其S基因型的鉴定,新发现了中国樱桃4个S单元型(Prunus pseudocerasus S-haplotypes, PpsS-haplotypes)。‘南京垂丝’的S基因型被鉴定为S-1/S-3’/S-5/S-7,每个PpsS-haplotype至少含有中国樱桃1个S-RNase基因(P.pseudocerasus S-RNase, PpsS-RNase)和中国樱桃1个SFB基因(P. pseudocerasus S-haplotype-specific F-box, PpsSFB)。这些PpsS-RNases和PpsSFBs分别在花柱和花粉中特异性表达,且与李属植物的S-RNases和SFBs具有相似的结构特征,满足作为S特异性识别决定因子的必要条件,并遵守四体遗传规律。c-DNAs全长序列分析表明,PpsS-haplotype-3’的SFB不能扩增成功,而PpsS-haplotype-3’的S-RNase以及其余PpsS-haplotype都未发现异常。自交授粉后,S基因型为S-7/S-1,S-7/S-5和S-1/S-5的二倍体花粉表现自交亲和性,而S基因型为S-3’/S-7,S-3’/S-1和S-3’/S-5的二倍体花粉则表现自交不亲和性。这些研究结果表明,PpsS-haplotype-1、-5和-7具有正常的S特异性识别,它们之中的任何2个S-haplotype之间的‘竞争性效应’导致了中国樱桃‘南京垂丝’表现自交亲和性。