APE1抑制剂对维莫非尼治疗甲状腺乳头状癌的协同作用及机制探讨

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研究目的:1、分析APE1在甲状腺乳头状癌中的表达情况及与患者临床病理特征的关系和临床意义。2、探讨APE1氧化还原抑制剂E3330对维莫非尼的体外协同作用。3、揭示APE1在维莫非尼治疗BRAF突变型甲状腺乳头状癌发生耐受的作用机制。4、体内验证E3330对维莫非尼抑制甲状腺乳头状癌进展的协同作用。研究方法:1、检索TCGA数据库并收集甲状腺乳头状癌新鲜标本,分析APE1蛋白在人体正常组织与甲状腺癌组织中的表达情况。2、应用免疫组化染色检测甲状腺乳头状癌患者组织中APE1的蛋白表达情况,并进行单因素及多因素回归分析APE1表达与患者临床病理特征的关系及临床意义。3、体外实验验证E3330对维莫非尼的协同作用。分别利用CCK-8实验、平板克隆实验、PI染色实验、Brdu染色实验、Annexin V-PI双染实验、JC-1染色实验、transwell实验及实验检测检测E3330及维莫非尼对BCPAP及K-1细胞增殖、周期、凋亡、线粒体功能、迁移及侵袭作用的影响。4、体外实验验证E3330联合维莫非尼诱导自噬过载所诱发的细胞衰老。利用免疫荧光实验、Western-blot实验及半乳糖苷酶染色实验检测E3330及维莫非尼对BCPAP及K-1细胞自噬底物蛋白含量及细胞衰老的影响。5、利用Western-blot实验、小干扰RNA敲弱实验、Co-IP实验验证E3330对维莫非尼协同作用的机制。6、尾静脉注射稳定表达GFP荧光蛋白的BCPAP细胞系建立BALB/c免疫缺陷小鼠甲状腺乳头状癌肺转移瘤模型,观察E3330协同维莫非尼对甲状腺乳头状癌的体内作用。结果:1、利用TCGA数据库检索并分析509例甲状腺乳头状癌患者及59例正常人中APE1蛋白表达水平,结果显示,APE1在甲状腺乳头状癌中高表达,且在新鲜甲状腺乳头状癌组织APE1的平均mRNA及蛋白表达水平高于正常组织。在石蜡标本中,APE1的蛋白表达水平高于正常组织。2、APE1组化染色评分与临床病理特征单因素分析结果显示,在甲状腺乳头状癌中,APE1的表达与BRAF突变、淋巴结转移及TNM分期具有明显相关性,而与性别、年龄、肿瘤多灶性、T分期无明显相关性。多因素Logistic分析结果显示,APE1表达、年龄、及T分期为甲状腺乳头状癌淋巴结转移的独立预后因素。同时我们在细胞系检测中检测APE1表达,结果示甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP、K-1、TPC-1、8505C、CAL-62中APE1 mRNA及蛋白质的表达均高于甲状腺正常细胞系Nthy-ori 3-1,且在BRAFV600E突变型甲状腺乳头状癌细胞系BCPCP及K-1中的表达相对较高。3、CCK-8细胞活性实验结果显示,与DMSO组相比,BCPAP及K-1的维莫非尼组、E3330组及联合加药组相对细胞活力均明显降低,且联合加药组对肿瘤细胞具有更高的生存抑制;PI染色检测细胞周期及Brdu实验结果示,与DMSO组相比,维莫非尼组及联合组肿瘤细胞均出现G1期阻滞,S期(DNA复制)细胞比例明显减少,且联合加药组具有更明显的阻滞作用。平板克隆实验结果示,与DMSO组相比,维莫非尼组、E3330组及联合加药组的细胞增殖能力均明显降低,且联合加药组对肿瘤细胞具有更高的增殖抑制;AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡实验结果示,与DMSO组相比,维莫非尼组、E3330组及联合加药组均明显提高了BCPAP及K-1的早期及晚期凋亡率,且在BCPAP中两药联用组凋亡发生率明显高于单独用药组;JC-1染色法检测线粒体电位结果示,与DMSO组相比,维莫非尼组、E3330组及两药联用均可引起BCPAP明显的线粒体电位降低,而维莫非尼组及两药联用组可引起K-1明显的线粒体电位降低;Western-blot检测凋亡相关蛋白结果示,线粒体凋亡途径相关蛋白Bcl-2明显降低、Bax及Cleaved-PARP明显升高,此外检测了细胞凋亡其他相关途径蛋白发现,与DMSO组相比,维莫非尼组、E3330组、联合加药组Cleaved-caspase3明显升高,凋亡抑制蛋白Survivin明显降低,且联合加药组变化程度明显于单独用药组。Tranwell迁移实验结果示,与DMSO组相比,BCPAP维莫非尼组及联合加药组穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显减少,而K-1维莫非尼组、E3330组及联合加药组穿过聚碳酸酯膜的细胞数量均明显减少,且联合加药组穿膜细胞数均明显少于单独用药组;Tranwell侵袭实验结果示,与DMSO组相比,BCPAP维莫非尼组及联合加药组,K-1维莫非尼组、E3330组及联合加药组穿过聚碳酸酯膜的细胞数量均明显减少,且联合加药组穿膜细胞数明显少于单独用药组。4、免疫荧光实验结果示,与DMSO组相比,维莫非尼组、E3330组及联合加药组均可不同程度自噬的升高,且联合加药组自噬增加水平更为明显,并出现LC3b、P62的积累,同时Western-blot检测LC3b、P62蛋白水平与免疫荧光结果一致,检测自噬上游调控蛋白结果示,维莫非尼组及联合加药组p-mTOR显著降低、p-AMPK和APG5蛋白水平显著升高,且联合加药组变化更为显著。半乳糖苷酶染色实验结果示,与对照组相比,联合加药组发生了细胞衰老。使用自噬激活剂Rapamycin设置三组实验结果示,与DMSO组相比,10uM维莫非尼+50uM E3330组、10uM Rapamycin组LC3b及P62均明显增加,同时衰老染色结果示,与DMSO组相比,两组均发生明显衰老现象。5、设置四组实验进行加药24h后,提取细胞蛋白进行Western-blot实验结果示,与DMSO组相比,三组p-MEK、p-ERK蛋白水平出现不同水平的降低,且联合加药组降低程度高于维莫非尼组;使用APE1小干扰RNA对其进行降表达,再次检测MAPK通路的激活情况结果示,敲弱APE1后,p-MEK、p-ERK蛋白水平随之降低;内源性Co-IP实验结果示,APE1与BRAF具有结合作用。6、动物体内结果示,所有小鼠均有肺转移,其中维莫非尼组出现1例肝转移,给药12天后,与空白对照组相比,维莫非尼组及联合加药组组转移瘤生长速度明显变慢,且联合加药组较维莫非尼组抑制作用更加明显;免疫组化结果显示:与空白对照组相比,维莫非尼组及联合加药组Ki-67明显减少,LC3b、P62表达明显增加,Cleaved-caspase3明显升高,且联合加药组变化较维莫非尼更为显著。结论:1、APE1在甲状腺乳头状癌中的表达明显高于正常组织;在甲状腺乳头状癌中,APE1的表达与BRAF突变、淋巴结转移及TNM分期均有显著相关性;APE1表达、年龄、及T分期为甲状腺乳头状癌淋巴结转移的独立预后因素。2、E3330可增强维莫非尼抑制甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP、K-1增殖、迁移、侵袭,促进凋亡、周期阻滞及诱导衰老的作用。3、APE1通过与BRAF结合保持其还原状态从而维持BRAF蛋白下游MAPK的持续激活。4、E3330在体内可协同维莫非尼抑制甲状腺乳头状癌进展。
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