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普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键的葡萄糖苷水解酶,应用在糖化过程中,可以提高支链淀粉的水解效率。然而,由于糖化条件具有高温、弱酸的特点,因此对普鲁兰酶的热稳定性和耐酸性要求较高。前期的研究工作已实现了Klebsiella variicola SHN-1普鲁兰酶基因在大肠杆菌中的表达,糖化过程具有高温(55℃–65℃)和弱酸性(p H 4.5–5.5)的特点,而K.variicola SHN-1普鲁兰酶的最适温度为53℃,最适p H为5.0,与糖化条件要求尚有差距。本研究在此基础上对普鲁兰酶进行定点突变,提高了普鲁兰酶的热稳定性和耐酸性。主要研究内容如下:(1)有研究表明,562F的改变对K.pneumoniae普鲁兰酶的热稳定性有影响。通过对K.variicola SHN-1普鲁兰酶的保守位点进行分析并与K.pneumoniae普鲁兰酶进行同源性分析,确定了对K.variicola SHN-1普鲁兰酶的581位苯丙氨酸进行饱和突变以研究该位点对普鲁兰酶热稳定性及催化活性的影响。通过分析K.variicola SHN-1普鲁兰酶的活性中心并将K.variicola SHN-1普鲁兰酶与K.pneumoniae,Bacillus acidopullulyticus,B.naganoensis普鲁兰酶氨基酸序列进行同源性比较,共确定了对H626D、R756E、H852D、R908E、I619N、F723Y、S850T、K851S八个位点进行突变以提高普鲁兰酶的耐酸性。(2)对581F进行定点饱和突变后,分析突变酶和野生型酶的酶学性质发现,与野生型酶相比,突变酶F581L、F581Q、F581R、F581T、F581V和F581Y的最适温度由53℃提高到56℃。通过对稳定性考察发现,上述突变酶在55℃下的半衰期分别比野生型提高了4.20、3.70、3.30、7.16、3.01、1.75 min。除了F581A和F581C,其他突变酶的T1550都有所提高。所有的突变酶的最适p H均没有发生变化。与野生型酶相比,突变酶F581L和F581V的Vmax值和kcat/Km值得到提高,表明它们拥有更高的催化效率。以K.pneumoniae普鲁兰酶的结构为模板,在SWISS-MODEL上模拟了K.variicola SHN-1普鲁兰酶的的结构。通过结构模拟分析发现,与野生型酶相比,突变体酶F581Q、F581R、F581T与周围氨基酸分形成更多的氢键从而提高了蛋白结构的稳定性。Leu和Val的疏水性均比Phe的疏水强,蛋白内部疏水作用的增加提高了蛋白结构的稳定性。因此突变体F581L和F581V的热稳定性也有了提高。(3)对H626D、R756E、H852D、R908E、I619N、F723Y、S850T、K851S共8个点进行定点突变,研究突变酶和野生型酶的酶学性质发现,突变酶H852D的最适反应p H由原来的p H 5.0降低为p H 4.7。突变酶K851S和H852D在低p H条件下的稳定性均优于野生型酶。所有突变酶的最适温度都与野生型酶的相同。通过同源建模及结构模拟分析发现,852位点突变为天冬氨酸后与周围的氨基酸多形成了2个氢键,因此提高了结构的稳定性,且由于碱性氨基酸突变为酸性氨基酸后造成活性中心p Ka值的改变,因此普鲁兰酶最适p H发生了迁移。