【摘 要】
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目的:研究miR-519b-3p在人类CRC组织和细胞系中的表达水平,进一步探索miR-519b-3p在CRC中的生物学功能和作用机制。方法:1.利用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）技术检测miR-519b-3p在CRC组织和对应癌旁组织、CRC上皮细胞系和正常结肠上皮细胞中的表达情况;2.构建miR-519b-3p的高表达组和敲减组后,利用CCK-8、transwell实验技术检测miR-
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目的:研究miR-519b-3p在人类CRC组织和细胞系中的表达水平,进一步探索miR-519b-3p在CRC中的生物学功能和作用机制。方法:1.利用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）技术检测miR-519b-3p在CRC组织和对应癌旁组织、CRC上皮细胞系和正常结肠上皮细胞中的表达情况;2.构建miR-519b-3p的高表达组和敲减组后,利用CCK-8、transwell实验技术检测miR-519b-3p对癌细胞的增殖和侵袭能力;3.使用Elisa和Western Blot检测Wnt信号通路的中下游蛋白、基因的表达水平,了解miR-519b-3p对Wnt信号通路的作用情况;4.预测并使用双荧光素酶报告基因试验验证miR-519b-3p可以靶向结合于u Mt CK的m RNA;5.q RT-PCR检测u Mt CK在CRC组织和癌旁正常组织中的表达水平;6.使用Western Blot和q RT-PCR验证u Mt CK在细胞系中和miR-519b-3p表达的关系;7.对细胞进行转染后,利用CCK-8和ranswell检测u Mt CK表达的恢复是否能够恢复miR-519b-3p对癌细胞的生物学功能的影响;8.TOPFlash报告基因检测转染后u Mt CK是否能调节miR-519b-3p对癌细胞中Wnt信号通路活性的影响。结果:1.在我们收集的48例患者样本中,q RT-PCR结果显示,miR-519b-3p在CRC组织中和细胞系中低表达,与相应癌旁正常组织和正常结肠细胞相比差异有统计学意义;2.在miR-519b-3p的高表达组、敲减组和阴性对照（NC）组中,高表达组的癌细胞增殖和侵袭能力最弱,与敲减组和NC组相比差异明显;3.在miR-519b-3p的转染细胞系中,高表达组的癌细胞中的Wnt通路的枢纽蛋白β-Catenin和下游基因c-myc、cyclin D1较敲减组和NC组均表达更低,差异有统计学意义;4.双荧光素酶报告基因试验中,miR-519b-3p能够明显抑制含野生型u Mt CK报告基因的荧光素酶活性,突变型无此现象;5.q RT-PCR结果显示u Mt CK在CRC组织中高表达,与癌旁正常组织相比差异明显;6.在miR-519b-3p的高表达组、敲减组和NC组中,u Mt CK的表达情况与miR-519b-3p的表达负相关,组间差异明显;7.构建miR-519b-3p mimics+u Mt CK组、miR-519b-3p mimics+vector组和NC组后进行CCK-8,和transwell试验,结果显示RKO、DLD-1中,NC组的细胞增殖和侵袭能力最强,miR-519b-3p mimics+u Mt CK组次之,miR-519b-3p mimics+vector组最弱,u Mt CK组和vector组的增殖和侵袭能力表现差异明显;8.在miR-519b-3p mimics+u Mt CK组、miR-519b-3p mimics+vector组和NC组中,利用TOPFlash报告基因试验检测Wnt通路活性,结果显示,Wnt通路的活性于NC组中最高,mimics+vector组中最低,在mimics+u Mt CK组的表现为稍低于NC组,与mimics+vector组差异明显。结论:miR-519b-3p在CRC中低表达,miR-519b-3p的高表达可以抑制CRC细胞的增殖和侵袭的作用,这种生物学作用是通过miR-519b-3p靶向作用于u Mt CK的m RNA进而调节Wnt信号通路完成的。
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