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目的:通过将分离纯化的人胎盘间充质干细胞（Human placental mesenchymal stem cells,hpMSCs）和人胎盘间充质干细胞外泌体（hpMSCs-ex）作用于脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导损伤的单层肺血管内皮及急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）小鼠,研究其对ALI时肺血管内皮通透性的影响以及作用机制。方法:1.Hp MSCs及hpMSCs-ex的分离、鉴定。（1）使用贴壁法分离纯化hpMSCs,在光镜下观察hpMSCs形态特征;用流式细胞仪检测hpMSCs表面特异性抗原表达;用特定诱导分化培养基培养hpMSCs,观察其向脂肪、成骨、成软骨三系细胞转化作用。（2）收集hpMSCs培养上清,用Exo Quick外泌体提取试剂盒提取hpMSCs-ex,在透射电镜下观察hpMSCs-ex形态特征,并通过蛋白免疫印迹实验（Western Blot）检测其表面特异抗原的表达。2.体外实验:观察hpMSCs、hpMSCs-ex对LPS诱导损伤的人肺血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMECs）的作用。（1）细胞损伤模型建立:使用终浓度为200 ng/m L的LPS处理HPMECs 6h诱导建立细胞损伤模型。（2）实验分组及方法:（1）分组:分为正常组（N组）、LPS组、hpMSC组、hpMSC-ex组。（2）方法:采用Transwell TM共培养装置,把hpMSCs或hpMSCs培养48h后上清液、hpMSCs-ex分别与LPS致损的HPMECs进行共培养。（3）检测指标:（1）光镜下观察HPMECs的形态特征;（2）观察hpMSC、hpMSCs-ex对LPS诱导损伤的HPMECs的作用:采用荧光显微镜观察各组Dil标记的hpMSCs-ex向HPMECs内的转移情况;用CCK-8法检测各组HPMECs的增殖率;（3）检测各组HPMECs线粒体功能及HPMECs线粒体自噬水平:采用JC-1染色检测各组HPMECs线粒体膜电位;利用Western Blot法检测各组HPMECs中线粒体释放的凋亡诱导因子（Apoptosis-inducing factor,AIF）表达水平;用透射电镜观察各组肺血管内皮细胞内细胞器的自噬情况;并收集提取各组肺血管内皮细胞蛋白,利用Western Blot法检测各组HPMECs自噬相关蛋白表达水平。（4）检测单层肺血管内皮通透性:利用荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-dextran）检测各组肺血管内皮通透性;利用Western Blot法检测各组HPMECs钙黏附蛋白（E-cadherin）表达水平。3.体内实验:检测hpMSCs、hpMSCs-ex对LPS诱导的ALI小鼠的作用。（1）ALI小鼠模型制备:给小鼠腹腔注射LPS（15mg/Kg体重）建立ALI小鼠模型。（2）实验分组及方法:（1）分组:正常组（N组）、ALI小鼠模型组（LPS组）、hpMSC组、hpMSC-ex组;（2）方法:hpMSC组:ALI小鼠经气管滴注hpMSCs,进行干预24h;hpMSC-ex组:ALI小鼠经气管滴注hpMSCs-ex,进行干预24h。（3）检测指标:计算各组小鼠肺组织病理损伤评分、透射电子显微镜（TEM）下各组小鼠肺组织变化情况、测定小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中炎症因子TNF-α水平、检测肺组织中伊文斯兰渗出量、检测肺组织E-cadherin、凋亡诱导因子（AIF）、自噬相关蛋白beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ及PINK1/parkin的表达。结果:1.（1）倒置显微镜下可见hpMSCs呈柳叶形,漩涡样贴壁生长,特定培养液可诱导其成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞转化,其表面抗原检测符合典型MSCs抗原表型:流式细胞仪检测hpMSCs表面抗原高表达CD105、CD90、CD73,不表达CD34、CD45和HLA-DR。（2）透射电镜下可见hpMSCs-ex双层膜结构,呈杯口状,直径在30-120nm之间,表面抗原CD9,CD63表达阳性。2.体外实验结果:（1）光镜下可见HPMECs形态良好,大小相似,外形呈椭圆形、圆形或短梭形。（2）hpMSCs-ex对各组HPMECs的作用:（1）荧光显微镜下可见Dil标记的hpMSCs-ex可向LPS诱导损伤的HPMECs内转移,呈明亮的颗粒状;（2）CCK-8法检测各组HPMECs增殖率:LPS组明显低于正常组（p<0.01）;hpMSC组和hpMSC-ex组的HPMECs增殖率明显高于LPS组（p<0.01）。（3）各组HPMECs线粒体功能及自噬相关蛋白表达:（1）JC-1荧光染色检测LPS组HPMECs线粒体膜电位明显低于正常组（p<0.01）;hpMSC组和hpMSC-ex组的HPMECs线粒体膜电位明显高于LPS组（p<0.01）;（2）肺血管内皮细胞中线粒体释放的凋亡诱导因子表达水平:与正常组相比,LPS组肺血管内皮细胞内线粒体释放的AIF蛋白表达水平明显升高（p<0.01）;与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组的HPMECs内线粒体释放的AIF蛋白表达水平明显下降（p<0.01）;（3）透射电镜观察结果:正常组HPMECs中线粒体嵴正常,未见自噬小体或自噬-溶酶体形成;LPS组的HPMECs内线粒体明显减少,部分线粒体嵴消失形成空泡,且未观察到自噬小体或自噬-溶酶体形成;hpMSC组HPMECs内可见线粒体呈致密型改变,但结构基本正常,可见呈双层膜结构的线粒体自噬小体,其内可见尚未完全溶解消失的嵴结构;hpMSC-ex组的HPMECs内可见线粒体结构基本正常,清楚观察到线粒体自噬小体及自噬-溶酶体。（4）自噬及线粒体自噬相关蛋白的检测结果:与正常组相比,LPS组肺血管内皮细胞自噬相关蛋白becline-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高（p<0.05）;与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组自噬相关蛋白becline-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高（p<0.01）;与正常组相比,LPS组肺血管内皮细胞线粒体自噬蛋白PINK1和parkin蛋白的表达增加（p<0.01）;与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组肺血管内皮细胞线粒体自噬蛋白PINK1和parkin蛋白的表达明显提高（p<0.01）。（4）检测单层肺血管内皮通透性:（1）FITC-dexstran检测单层肺血管内皮通透性结果显示:与正常组相比,LPS组的FITC-dexstran荧光强度明显升高,表明肺血管内皮通透性显著增加（p<0.01）;与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组FITC-dexstran荧光强度明显下降,表明hpMSC组和hpMSC-ex组单层肺血管内皮通透性明显降低（p<0.01）;（2）HPMEC的E-cadherin表达:与正常组相比,LPS组E-cadherin表达量明显减少（p<0.01）;而hpMSC组和hpMSC-ex组的E-cadherin表达水平显著高于LPS组（p<0.01）。3.体内实验结果:（1）肺组织病理损伤评分结果显示:与正常组相比,LPS组肺组织病理损伤评分升高明显（p<0.01）;与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组的肺组织病理损伤评分明显下降（p<0.01）。（2）透射电镜观察结果显示:正常组PMECs及Ⅱ型细胞内细胞器正常,基膜完整。LPS组PMECs线粒体嵴消失,基膜明显增厚且双层膜结构破坏;Ⅱ型细胞细胞核浓缩样改变,嗜锇小体板的正常层状结构消失,部分小体大量排空,细胞肺泡面微绒毛消失,可见向肺泡渗出的多型核白细胞。hpMSC组内可见PMECs细胞核形态正常,线粒体肿胀但线粒体嵴尚完整,基膜较正常组增厚部分完整性破坏,可见清晰的双层膜结构;Ⅱ型细胞细胞核正常,嗜锇小体板层状结构存在,细胞肺泡面微绒毛存在,部分断裂消失。hpMSC-ex组内可见PMECs细胞核正常,线粒体肿胀但线粒体嵴间隙增宽,基膜较正常组增厚部分完整性破坏,可见清晰的双层膜结构（D1-c）。Ⅱ型细胞细胞核正常,嗜锇小体板层状结构存在,细胞肺泡面微绒毛存在,部分断裂消失。（2）肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α水平:与正常组相比,LPS组小鼠BALF中炎症因子TNF-α显著升高（p<0.01）,与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组BALF中的炎症因子TNF-α含量明显减少（p<0.01）。（3）肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α水平:与正常组相比,LPS组小鼠BALF中炎症因子TNF-α显著升高（p<0.01）,与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组BALF中的炎症因子TNF-α含量明显减少（p<0.01）。（4）伊文斯兰渗透实验结果:与正常组相比,LPS组小鼠肺组织伊文斯兰含量明显增加（p<0.01）;与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组小鼠肺组织内伊文斯兰含量则显著下降。（p<0.01）。（5）E-cadherin表达结果显示:与正常组相比,LPS组E-cadherin表达量明显减少（p<0.01）;与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组的E-cadherin表达量显著增加（p<0.01）。（6）线粒体凋亡诱导因子（AIF）表达:与正常组相比,LPS组线粒体AIF表达水平增加,与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组线粒体AIF表达水平显著下降（p<0.01）。（7）自噬相关蛋白表达:与正常组相比,LPS组beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ和PINK1/parkin蛋白表达水平增加（p<0.01）;与LPS组相比,hpMSC组和hpMSC-ex组beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ和PINK1/parkin蛋白表达水平明显增加（p<0.01）。结论:1人胎盘间充质干细胞外泌体可促进ALI时的肺血管内皮细胞修复而改善肺血管内皮通透性。2人胎盘间充质干细胞外泌体可促进ALI时肺血管内皮细胞线粒体自噬。