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马氏珍珠贝（Pinctada martensii Dunker）主产于广西北海,是海水珍珠的基原动物。2020版《中国药典》记载珍珠味甘、咸、寒,入心、肝经,有安神定惊、明目消翳、解毒生肌、润肤祛斑的功效;珍珠母味咸性寒,归肝、心经,具有平肝潜阳,安神定惊,明目退翳的功效。源于马氏珍珠贝的珍珠和珍珠母应用于中医临床已有千年历史,其珍珠和贝壳均是重要的传统中药,历代本草均有记载。然而,在生产加工珍珠和珍珠母过程中,孕育珍珠的母体马氏珍珠贝软体仅部分作为食用,大部分作为废弃物被丢弃,造成资源浪费,且污染海域环境。现代研究表明马氏珍珠贝软体富含蛋白质类、多烯不饱和脂肪酸类,及人体所需的各种无机盐和微量元素,营养物质丰富。本论文以马氏珍珠贝软体为研究对象,采用酶解技术,从酶解工艺优化、物质基础、降糖活性评价、降糖机制、摄取和转运及制剂工艺等几个方面进行研究,主要内容如下:一、文献研究对海洋贝类的利用现状、海洋贝类活性肽功能及活性评价研究情况、活性肽的制备和鉴定进行了综述,同时对贝类活性肽的发现应用进行了展望。二、马氏珍珠贝软体酶解工艺优化研究以二肽基肽酶-Ⅳ（dipeptidylpeptidase,DPP-Ⅳ）抑制活性和HepG-2细胞的葡萄糖消耗量为指标优化马氏珍珠贝软体的酶解工艺,确定最优工艺为:酸性蛋白酶酶解,温度45℃,时间3 h,料液比1:3.5,加酶量1000 U/g。此条件下的DPP-Ⅳ抑制率为74.21%,HepG-2细胞葡萄糖消耗量为37.53%。三、马氏珍珠贝软体酶解肽的物质基础研究通过苯酚-硫酸法测得马氏珍珠贝软体酶解肽的总糖含量为12.99%±0.62%,采用多肽试剂盒测得其多肽含量为69.74%±1.52%。经过nano-LC-MS/MS鉴定了 263条肽段,其中44.11%的肽段为疏水性肽段,60.08%的肽段N端至少有含有一个疏水性氨基酸,85.17%的肽段分子量低于2000 Da。四、马氏珍珠贝软体酶解肽降糖活性评价研究采用自发性糖尿病db/db小鼠,对马氏珍珠贝软体酶解肽降糖活性进行评价研究。以西格列汀盐酸二甲双胍为阳性药,灌胃马氏珍珠贝软体酶解肽高（900mg/kg）、低剂量（300 mg/kg）,比较给药前后对db/db糖尿病模型小鼠的血糖指标、血脂及对PI3K-AKT经典通路关键蛋白表达的影响。结果表明,马氏珍珠贝软体酶解肽能降低db/db小鼠的血糖,改善葡萄糖耐量和胰岛素耐量,增加肝组织中IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的含量;降低血清中TC、TG、LDL-C、ALT、AST含量,升高HDL-C含量,提示马氏珍珠贝软体酶解肽能改善2型糖尿病（type 2 diabetes,T2DM）小鼠血脂代谢,激活PI3K-AKT通路。五、基于蛋白质组学研究马氏珍珠贝软体酶解肽降糖活性的潜在通路研究采用非标记定量（Label free quantitative,LFQ）蛋白质组学的方法,对空白组、模型组、马氏珍珠贝软体酶解肽组小鼠肝脏中的蛋白质进行定性、定量分析。对筛选的差异蛋白（p＜0.05）进行KEGG和GO分析,筛选得到与T2DM相关的蛋白及马氏珍珠贝软体干预后的相关蛋白变化与调节通路,并采用western blot和qRT-PCR验证差异蛋白在在不同组之间蛋白水平和mRNA水平的表达差异。结果得到马氏珍珠贝软体酶解肽调控T2DM的231个潜在差异蛋白,筛选出参与T2DM 的蛋白生物标志物（p＜0.05,|log2FC|＞1.2）主要有 Cyp1a2、Mup20、Cyp2a5、Lumican、Col6a1、Mrp13、Etnppl、Dynlrb1、Gsdmdc1、Slc10a1、Bclf1、H2-D1、Magohb、Cyp2a4、Magoh,涉及视黄醇代谢通路、氧化磷酸化、糖酵解/糖异生等过程,细胞质、线粒体等细胞组分,小分子代谢过程、氧化还原过程、药物代谢过程、核苷酸代谢过程等生物过程,氧化还原酶活性、催化活性、小分子结合、辅因子结合等分子功能。马氏珍珠贝软体酶解肽高剂量组能显著上调小鼠肝脏中Cyp1a2、Adh4、Rdh11的表达,显著下调小鼠肝脏中Aldh1a1、Retsat mRNA的表达,提示马氏珍珠贝软体酶解肽可能通过调节视黄醇代谢通路改善T2DM。对筛选到的其他差异蛋白进行验证,结果表明马氏珍珠贝软体酶解肽高剂量组能显著上调小鼠肝脏中Col6a1、Lumican、Magohb、Mup 20 mRNA、H2-D1 mRNA的表达,提示马氏珍珠贝软体酶解肽可能通过增加细胞粘附,调节视网膜清晰度,进而改善糖尿病视网膜病变。六、马氏珍珠贝软体酶解肽的摄取和转运研究采用等重二甲基标记法对马氏珍珠贝软体酶解肽进行标记,基于Caco-2细胞研究马氏珍珠贝软体酶解肽的摄取和转运。将标记肽给予Caco-2细胞2h后,对照组的细胞内容物中鉴定到90条肽段,给药组中鉴定到99条肽段,去除对照组中的肽段,给药组中鉴定到23条肽段与标记肽重合,表明这23条肽段可能被Caco-2细胞所摄取;将Caco-2细胞接种于transwell板,培养21 d后,将标记肽给予Caco-2细胞,于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h分别取transwell板下室样品进行nano LC-MS/MS检测、PEAKS搜库,发现标记肽给药0.5 h后,Caco-2细胞能转运95%以上的肽段,并且在给药1 h后转运达到饱和,随时间延长转运率几乎无变化。七、马氏珍珠贝软体酶解肽的制剂工艺研究前期研究发现复合蛋白酶与酸性蛋白酶得到的酶解肽降糖活性相当,但酸性蛋白酶酶解条件较繁琐,故在中试时选择复合蛋白酶进行酶解。本文通过复合蛋白酶对马氏珍珠贝软体进行酶解,以得粉率和吸湿率为指标对酶解液的喷干工艺进行优化,结果表明酶解液中加入固含40%微晶纤维素,喷干温度为130℃,进样流速为6.0 mL/min进行喷雾干燥,得到的中间体吸湿性最好。马氏珍珠贝软体腥味较重,以此为原材料制得的酶解液依然保存其腥味且极易吸潮,拟制成片剂。确定润湿剂为95%乙醇,湿法制粒时再加入40%的山梨糖醇和0.5%硬脂酸镁,进行压片,每片0.5g,制得“珍珠贝肽片”。研究“珍珠贝肽片”的质量,对片剂常规项目进行检查,最后拟定“珍珠贝肽片”质量（草案）。