【研究背景】血管钙化（vascular calcification,VC）是血管壁间叶细胞,尤其是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）在各种病理因素作用下转化为成骨细胞,并导致钙盐异常沉积在血管壁的过程。血管钙化导致血管局部缺氧和代谢失调,是糖尿病、尿毒症和衰老的常见并发症。血管钙化是一个与成骨转化类似的、主动的可调控的生物学过程,而VSMC向成骨样细胞的表型转换在血管钙化过程中起核心作用,其发展过程中相关基因的表达调控与成骨细胞的成熟分化十分相似。血管钙化降低血管顺应性,导致血管局部缺氧和代谢失调,并增加了血管破裂和动脉瘤形成的风险。尽管对血管钙化进行了广泛的研究并耗费了巨大的医疗成本,目前还没有任何治疗方法可以阻止或逆转其进程,因此,阐明血管钙化的发病机制,寻找其潜在预防和治疗靶点具有重要的研究意义。血管局部糖酵解增加和乳酸堆积是导致血管钙化和表型转换的重要因素。近期研究表明,在糖尿病动脉粥样硬化和主动脉瓣膜钙化过程中,果糖-2,6-二磷酸酶3（fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3）的表达显著增加。PFKFB3是糖酵解关键酶6-磷酸果糖激酶-1的同分异构体,其表达上调可激活糖酵解途径并导致过量乳酸堆积。既往有文献表明,血管局部糖酵解产物增加可导致慢性肾病大鼠血管钙化水平显著升高。最近的一项关于VSMC钙化相关研究显示,乳酸通过抑制BNIP3介导的有丝分裂加速血管平滑肌细胞的表型转换,最终导致血管平滑肌细胞的表型转换及钙沉积量增加。这表明调节血管局部糖酵解可能实现抑制VSMC表型转换,进而达到抑制血管钙化的目的。阿片及阿片受体（opioid receptor,OR）在机体内广泛存在,主要包括μ,δ,κ三种类型在内的多种亚型,其中κ-阿片受体（κ-opioid receptor,κ-OR）在心血管系统中占主导地位。课题组前期研究证实,选择性κ-OR激动剂U50,488H可以通过活化心血管κ-OR来改善血管内皮功能和局部缺氧并逆转血管重塑。此外,在低氧性肺动脉高压中,U50,488H活化κ-OR后可通过抑制肺平滑肌细胞内钙信号而发挥对心血管的保护作用。这些研究均提示了κ-OR激活后可能对血管钙化具有调节作用,但具体的作用及机制尚待进一步研究。由于U50,488H可以通过血脑屏障,并引起阿片类物质的成瘾,从而明显限制其临床应用,为了深化研究κ-OR活化对血管钙化防治作用并将研究成果进行临床转化,本研究对κ-OR激动剂U50,488H的结构进行了季胺化改造,获得了一种新型化合物:季胺化U50,488H（quaternary ammonium salt of U50,488H,QU50,488H）。课题组前期研究表明,Q-U50,488H因其增加了水溶性不能通过血脑屏障,克服了U50,488H通过血脑屏障后可能带来的成瘾性,进一步研究证实其可通过激活κ-OR对缺血心肌具有保护作用。但Q-U50,488H是否能够通过活化κ-OR调节血管钙化尚不清楚,其对心血管保护的作用及具体机制尚未阐明,Q-U50,488H能否逆转VSMC表型转换,改善局部钙磷比及糖酵解水平尚未见报道。深入探讨上述问题可为预防和治疗血管钙化提供理论基础和治疗靶点。【研究目的】1.探究季胺化U50,488H对慢性肾病大鼠血管钙化和表型转换的影响2.探究季胺化U50,488H对高磷诱导的VSMC钙化的影响3.阐明季胺化U50,488H对血管钙化的调节机制【研究方法】1.使用κ-OR激动剂U50,488H和CH3I为原料,通过化学合成的方法对U50,488H进行季胺化改造合成Q-U50,488H;通过高分辨率质谱鉴定合成化合物分子量。2.联合使用尼古丁和维生素D3建立慢性肾病大鼠钙化模型,雄性健康Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分组,通过茜素红、Von Kossa和HE等钙病理染色检测大鼠胸主动脉钙沉积量;通过Micro CT检测大鼠主动脉钙结节大小和总体积;通过Western blotting检测VSMC内RUNX2,BMP2和SM22α表达水平。3.在细胞水平,分离并培养SD大鼠胸主动脉VSMC,通过免疫荧光检测平滑肌特异性蛋白α-SMA鉴定细胞;使用β-GP诱导VSMC钙化,使用Q-U50,488H和κ-OR阻断剂nor-BNI进行处理。通过Western blotting检测VSMC内RUNX2,PHD2,HIF-1α和PFKFB3表达水平;通过茜素红和Von Kossa染色检测VSMC钙沉积量;收集细胞培养上清通过试剂盒化学比色法检测VSMC钙含量,乳酸含量以及ALP和LDH活力;通过CCK8实验检测VSMC活力;通过共聚焦免疫荧光检测PFKFB3表达水平。4.通过使用小干扰RNA和小分子抑制剂3-PO抑制VSMC的PFKFB3表达水平;通过构建PFKFB3过表达质粒并包装腺病毒增加PFKFB3表达水平,使用对照腺病毒（Ad-EV）和PFKFB3过表达腺病毒（Ad-PFKFB3）联合Q-U50,488H处理高磷诱导的VSMCs;通过乳酸钠诱导VSMC钙化并使用Q-U50,488H和nor-BNI进行处理。【研究结果】1.U50,488H季胺化改造完成后,使用高分辨率质谱分析,合成物离子分子量为383.1657,与理论值误差小于0.005‰,证实合成Q-U50,488H成功。2.与对照组SD大鼠相比,钙化组大鼠体重显著低于对照组,尿肌酐和血尿素氮水平显著升高达到尿毒症标准,并出现了明显的慢性肾病末期尿毒病症状。这些数据表明慢性肾病大鼠模型建立成功。3.钙化病理染色和影像学结果显示,与钙化组相比,Q-U50,488H处理通过活化κ-OR抑制慢性肾病大鼠主动脉钙沉积量,降低主动脉钙结节数量和总体积;Western blotting检测证实Q-U50,488H通过活化κ-OR升高平滑肌特征蛋白SM22α表达,降低成骨标志蛋白RUNX2和BMP2表达。Q-U50,488H的这些效应均可被nor-BNI所阻断。4.细胞水平研究结果表明,Q-U50,488H以浓度依赖的方式降低高磷诱导VSMC的RUNX2表达水平;相比于高磷诱导的VSMC,Q-U50,488H通过活化κ-OR降低高磷诱导的VSMC钙化沉积量,并可增加VSMC细胞活力;Western blotting结果显示,Q-U50,488H通过活化κ-OR增加高磷诱导的VSMC的PHD2表达水平,降低HIF-1α和PFKFB3表达;试剂盒化学比色法结果显示,Q-U50,488H降低高磷诱导的VSMC乳酸和LDH含量。5.使用小干扰RNA和小分子抑制剂3-PO敲低和抑制高磷诱导VSMC的PFKFB3表达结果表明,PFKFB3表达降低可抑制高磷诱导VSMC钙化和表型转换;PFKFB3过表达腺病毒联合Q-U50,488H实验结果表明,PFKFB3过表达可阻断Q-U50,488H降低高磷诱导VSMC钙化和逆转表型转换的作用;茜素红染色和Western blotting实验证实,Q-U50,488H通过活化κ-OR降低乳酸导致VSMC钙化和表型转化。【结论】1.季胺化U50,488H通过活化κ-OR减轻慢性肾病大鼠血管钙化和表型转换。2.季胺化U50,488H可通过活化κ-OR下调PFKFB3表达和降低乳酸含量进而降低高磷诱导的VSMC钙化。