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猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病，是OIE规定的必须通报的A类动物传染病之一。猪瘟兔化弱毒(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)是世界公认的最安全、免疫效果最好的猪瘟疫苗毒株，也是我国唯一使用的猪瘟疫苗毒株。CSFV只感染猪。HCLV只引起家兔发生热反应，在敏感的细胞培养物生长繁殖后，无CPE出现。家兔热反应是HCLV病毒效价测定和CSF疫苗成品效力检验的主要方法。HCLV所致的家兔热反应存在个体差异大和测定时间长(3-9天)等问题。此外，现有荧光抗体技术不适用于成品和半成品中的牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)污染的检测。据报道，猪瘟疫苗中污染BVDV后，HCLV有效免疫原量减少，致使临床使用后发生猪瘟免疫失败。同时，BVDV可引起猪只发生类似猪瘟的疫病，导致疫苗接种猪发病或死亡。因此，研究可替代兔热法的HCLV效价测定和效力检验方法，以及能够用于猪瘟疫苗生产中半成品和成品BVDV污染检测的新技术具有重大经济价值和社会意义。
本文报道用于HCLV的效价和效力检测的荧光定量PCR(Real time FluorogeneticQuantitative PCR，FQ-PCR)、WH303单抗荧光TCID50(McAb-FITCID50)及检测猪瘟疫苗中BVDV污染的FQ-PCR试剂盒的研制结果。
1、HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR根据GenBank公布的CSFV全序列、BVDV全序列和绵羊边界病病毒(Border Disease Virus，BDV)全序列综合比对分析结果，分别设计针对HCLV和BVDV的特异性TaqMan-MGB荧光探针和引物，构建阳性标准品，建立起HCLV和BVDV的特异的绝对定量FQ-PCR试剂盒。结果显示，HCLV FQ-PCR检测灵敏度为4.35个核酸拷贝量，CT值与模板之间相关系数为0.9998，扩增效率为101.14％，40个质控样本保存6个月，CT值变异系数为1.1～4.0％；BVDV FQ-PCR方法CT值与模板之间相关系数为0.9978，扩增效率为95.68％，20个质控样本保存6个月，CT值变异系数为1.1～2.4％。对CSFV、BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9种猪病相关病原的检测结果显示，HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR试剂盒均只能在HCLV或BVDV样品出现阳性反应。结果表明，HCLVFQ-PCR和BVDV FQ-PCR试剂盒均具有高度特异性、敏感性和稳定性。
2、McAb-FITCID50法CSFV单抗WH303杂交瘤细胞来自英国兽医实验室(VeterinaryLaboratories Agency，VLA)。采用FITC标记WH303 McAb，对细胞接种HCLV后进行原位直接免疫荧光检测，可测定HCLV TCID50，从而实现病毒含量的定量检测。实验结果显示，McAb-FITCID50法特异性好，与BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9种病毒无交叉反应。
3、猪瘟疫苗半成品效价应用检测来自4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗半成品稀释100万倍后，同时采用兔热反应、HCLV FQ-PCR和McAb-FITCID50测定，结果是，两只兔子均无热反应(不合格)样品共11份，FQ-PCR CT值为21.15～27.30，对应病毒核酸量为8.80×102copy/μL～6.52×104copy/μL，McAb-FITCID50值为10-0.6/0.1mL～10-2.5/0.1mL；两只兔子呈现一只定性热一只无热反应，或者一只呈现轻热反应一只无热反应，或者两只都呈现轻热反应(可疑)样品共12份，cT值为17.47～23.70，病毒含量为1.10×104copy/μL～8.55×105copy/μL，McAb-FITCID50值为10-2.4/0.1mL～10-3.76/0.1mL；两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应(合格品)样品共11份，CT值为17.10～20.80，病毒含量为8.27×104copy/μL～1.11×106copy/μL，McAb-FITCID50值为10-2.88/0.1mL～10-4.54/0.1mL。结果显示，HCLV FQ-PCR和McAb-FITCID50测定结果与家兔热反应测定结果存在良好的相关性，可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV效价检测。
4、猪瘟疫苗半成品及成品中BVDV污染检测来自不同厂家不同批次的猪瘟疫苗半成品58份及成品36份，BVDV FQ-PCR检测阳性率分别为20.7％和22.2％。检测结果提示，我国猪瘟疫苗中BVDV污染较为严重。
研究结果表明，FQ-PCR和McAb-FITCID50试剂盒测定半成品中HCLV效价、检验成品效力和BVDV污染情况，显示出高度的灵敏度，很好的特异性和重复性，可以用于替代HCLV家兔热反应方法。