DJ-1通过C106位点氧化态依赖性的方式介导H9c2心肌细胞缺氧/复氧状态下的损伤性自噬

来源 :南昌大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wytlxj
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目的:以DJ-1蛋白C106位点氧化修饰为切入点,从H9c2心肌细胞水平探讨DJ-1蛋白是否以C106位点氧化态依赖性方式参与了缺氧/复氧(A/R)所诱导的损伤性细胞自噬。方法:1.将浓度为5 m M的自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)或浓度为50μM的自噬激动剂Rapamycin(Rapa)与H9c2心肌细胞共孵育12 h,然后进行3 h缺氧+2 h复氧构建A/R损伤模型。通过检测以下指标的变化,验证A/R是否引起H9c2心肌细胞损伤性自噬以及DJ-1蛋白C106位点氧化:(1)流式细胞术测定细胞内活性氧(ROS)的变化;(2)Western Blot和免疫沉淀法(IP)检测细胞内氧化态DJ-1(ox-DJ-1)和自噬标志蛋白P62、LC3的表达水平;(3)CCK-8法测定细胞存活率以及分光光度法测定细胞内乳酸脱氢酶(LDH)的释放。2.分别利用100、200、400μM的氧化剂H2O2预处理H9c2心肌细胞4 h促使DJ-1蛋白C106位点氧化,通过检测以下指标的变化,探讨DJ-1蛋白C106位点氧化生成ox-DJ-1后是否诱导H9c2心肌细胞内损伤性自噬:(1)流式细胞术测定细胞内ROS的变化;(2)Western Blot和IP检测细胞内ox-DJ-1和自噬标志蛋白P62、LC3的表达水平;(3)激光共聚焦检测细胞内m RFP-GFP-LC3双荧光示踪的自噬流的变化;(4)CCK-8法测定细胞存活率以及分光光度法测定细胞内LDH的释放。3.将500μM的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)与H9c2心肌细胞共孵育12 h抑制DJ-1蛋白C106位点氧化,然后建立A/R损伤模型。通过检测以下指标的变化,进一步探讨下调ox-DJ-1表达水平是否可以抑制H9c2细胞内A/R所诱导的损伤性自噬:(1)流式细胞术测定细胞内ROS的变化;(2)Western Blot和IP检测细胞内ox-DJ-1和自噬标志蛋白P62、LC3的表达水平;(3)透射电镜观察细胞内自噬体的变化;(4)激光共聚焦检测细胞内m RFP-GFP-LC3双荧光示踪的自噬流的变化;(5)CCK-8法测定细胞存活率以及分光光度法测定细胞内LDH的释放。4.利用野生型DJ-1稳定高表达的H9c2/DJ-1细胞及C106位点突变型DJ-1(C106S)稳定过表达的H9c2/DJ-1(C106S)细胞,分别经400μM H2O2预处理4 h后,建立A/R损伤模型,通过检测以下指标的变化,观察H2O2预处理H9c2/DJ-1细胞致使ox-DJ-1显著上调后是否促进A/R所诱导的损伤性自噬,同时观察上述效应在H9c2/DJ-1(C106S)细胞内是否因DJ-1蛋白C106位点突变致使ox-DJ-1生成减少而被抑制:(1)流式细胞术测定细胞内ROS的变化;(2)Western Blot和IP检测细胞内ox-DJ-1和自噬标志蛋白P62、LC3的表达水平;(3)透射电镜观察细胞内自噬体的变化;(4)激光共聚焦检测细胞内m RFP-GFP-LC3双荧光示踪的自噬流的变化;(5)CCK-8法测定细胞存活率以及分光光度法测定细胞内LDH的释放。5.利用5μM特异性DJ-1蛋白C106位点氧化抑制剂Compoud-23(Comp-23)预处理H9c2心肌细胞12 h,然后建立A/R损伤模型,通过检测以下指标的变化,进一步明确DJ-1蛋白C106位点氧化在A/R所诱导的损伤性自噬中的作用:(1)流式细胞术测定细胞内ROS的变化;(2)Western Blot和IP检测细胞内ox-DJ-1和自噬标志蛋白P62、LC3的表达水平;(3)激光共聚焦检测细胞内m RFP-GFP-LC3双荧光示踪的自噬流的变化;(4)CCK-8法测定细胞存活率以及分光光度法测定细胞内LDH的释放。结果:1.与Control组的细胞相比较,H9c2心肌细胞经A/R处理后自噬水平明显上升,表现为LC3-II/LC3-I比值的升高、P62蛋白表达水平的下降,同时,细胞存活率降低并且LDH释放量增加。然而,自噬抑制剂3-MA预处理抑制A/R状态下的自噬水平后,细胞存活率明显升高并且LDH释放量明显减少。相反,自噬激动剂Rapa预处理增加A/R状态下的自噬水平后,细胞存活率进一步下降且LDH释放量进一步增加。以上结果提示,在H9c2心肌细胞,A/R可诱导损伤性细胞自噬。此外,H9c2心肌细胞经A/R处理后ROS水平显著增加,ox-DJ-1表达水平显著上调,提示H9c2心肌细胞A/R状态下的损伤性自噬可能与DJ-1蛋白C106位点氧化生成的ox-DJ-1有关。2.与Control组细胞相比,不同浓度(100、200、400μM)氧化剂H2O2预处理H9c2细胞后,伴随着细胞内ROS水平升高,可浓度依赖性上调ox-DJ-1表达水平,同时浓度依赖性降低P62蛋白表达水平、升高LC3-II/LC3-I比值,增强细胞内自噬流,并且浓度依赖性降低细胞存活率、增加LDH释放量。此外,H2O2预处理显著上调H9c2细胞内ox-DJ-1表达后所产生的上述效应与A/R组相一致。以上结果提示C106位点氧化生成的ox-DJ-1可能参与了H9c2细胞A/R状态下的损伤性自噬。3.与A/R组细胞相比,经抗氧化剂NAC预处理后,可使A/R的H9c2细胞内ROS水平明显降低,ox-DJ-1表达水平随之降低,伴随着P62蛋白表达水平的升高,LC3-II/LC3-I比值的降低,细胞内自噬流减弱,自噬体数量明显减少,同时,细胞存活率升高且LDH释放量减少。以上结果提示抑制DJ-1蛋白C106位点氧化,减少ox-DJ-1表达水平可缓解H9c2心肌细胞A/R状态下的损伤性自噬。4.H9c2/DJ-1细胞A/R前经H2O2预处理,可显著升高ox-DJ-1水平,同时促进A/R所诱导的损伤性自噬,表现为LC3-II/LC3-I比值升高,P62蛋白水平降低,自噬流增强,自噬体数量增加,此外,伴随着细胞存活率降低且LDH释放量升高;然而,H9c2/DJ-1(C106S)细胞A/R前经H2O2预处理,因C106位点突变致使ox-DJ-1表达水平无显著变化,同时对A/R所诱导的损伤性自噬也无显著影响。以上结果表明,促进DJ-1蛋白C106位点的氧化,上调ox-DJ-1水平可促进H9c2细胞A/R状态下的损伤性自噬,而C106位点突变可抑制这种促进效应。5.H9c2细胞A/R前经特异性DJ-1蛋白C106位点氧化抑制剂Comp-23预处理,可显著降低ox-DJ-1表达水平,同时伴随着P62蛋白水平的升高,LC3-II/LC3-I比值的降低,细胞内自噬流减弱,细胞存活率升高,LDH释放量减少。以上结果表明,抑制DJ-1蛋白C106位点氧化,降低ox-DJ-1水平可抑制H9c2细胞A/R状态下的损伤性自噬。上述结果也进一步提示DJ-1蛋白可能通过C106位点氧化态依赖性的方式介导了H9c2细胞A/R状态下的损伤性自噬。结论:本研究在H9c2心肌细胞水平证实A/R可促使DJ-1蛋白C106位点氧化,并可诱导损伤性细胞自噬;DJ-1蛋白可能通过C106位点氧化态依赖性的方式介导了H9c2心肌细胞A/R状态下的损伤性自噬。
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