淡色库蚊两种精氨酸激酶基因的克隆、表达及其对生长发育和吸血行为的影响

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精氨酸激酶是昆虫生命活动过程中参与能量代谢的关健性酶,由于精氨酸激酶仅存在于无脊椎动物中,并且该酶及其磷酸原的能量代谢途径与哺乳动物中的完全不同。因此精氨酸激酶可以作为防治昆虫的一个很好的杀虫剂作用靶标。本文以重要卫生害虫淡色库蚊Culexpipienspallens作为研究对象,发现并成功克隆出两种精氨酸激酶基因CppAK1和CppAK2全长序列,对CppAK1和CppAK2进行了序列同源性和系统发生分析,利用定量PCR、体外表达、RNA干扰等分子生物学技术分析CppAK1和CppAK2在淡色库蚊不同组织、不同发育阶段的表达模式及其对生长发育和吸血行为的影响,研究结果对开发以AK作为靶标的新型蚊虫防治药剂具有重要的理论依据和实践价值。本文主要研究结果如下:克隆了CppAK1和CppAK2的全长序列,其中CppAK1全长序列为1454bp,编码410个氨基酸;CppAK2全长序列为1799 bp,编码466个氨基酸。通过对两种精氨酸激酶基因多重序列比对分析发现,CppAK1和CppAK2的氨基酸序列一致性仅为64.76%。系统发生分析也表明,双翅目昆虫如埃及伊蚊、白纹伊蚊、黑腹果蝇等的AK基因聚为一类,蚊科的大部分AK2基因与众多AK1很早就分离,显示出不同的类群。使用原核表达对CppAK1和CppAK2的酶性质进行了比较分析,结果显示两种精氨酸激酶的催化活性有较大差别,CppAK1的各项参数都优于CppAK2。在不同温度下CppAK1对底物的催化速率普遍高于CppAK2,CppAK1在30-45℃的温度区间内保持较高催化效率,CppAK2的最佳催化速率低于CppAK1。在不同pH环境中,CppAK1和CppAK2都在pH 7.5时达到最高催化速率。表明温度和pH值是影响淡色库蚊精氨酸激酶活性的重要影响因素。通过实时荧光定量PCR检测了 CppAK1和CppAK2在淡色库蚊不同发育阶段和不同组织中的表达量。结果表明,CppAK1和CppAK2在淡色库蚊各个发育阶段均有表达,且CppAK1的表达量显著高于CppAK2。CppAK1的表达量在卵期最高,与其他龄期相比存在极显著差异。CppAK2在卵期、蛹期的表达量较高,与其他发育阶段的表达量相比差异显著。对淡色库蚊不同组织的检测发现,CppAK1和CppAK2在不同的组织中均有表达,且CppAK1的表达量显著高于CppAK2。CppAK1在胸部肌肉组织中表达量最高,有极显著差异。表达量从高到低依次是胸部、发育阶段卵巢、头部、吸血前卵巢、马氏管、脂肪体、中肠、唾液腺。CppAK2在吸血前卵巢中表达最多,其次是脂肪体,表达量从高到低依次是吸血前卵巢、脂肪体、发育阶段卵巢、胸部、头部、马氏管、唾液腺、中肠。研究了CppAK1和CppAK2对淡色库蚊生长发育的影响。采用显微注射的方法对淡色库蚊未吸血的雌性成虫进行RNA干扰,结果表明,注射dsCppAK1后雌蚊存活率降至56.4%,显著高于对照中的死亡率。注射dsCppAK2后雌蚊存活率降至76.5%,同时注射dsCppAK1和dsCppAK2后雌蚊存活率降至25.7%,同样具有显著性差异。注射1日后,让蚊虫吸血,观察其产卵量、平均产卵数和孵化率,发现注射dsCppAK1的雌蚊所产的卵块平均含卵数下降了 21.3%,注射dsCppAK2的卵块平均孵化数下降了24.9%,同时注射dsCppAK1和dsCppAK2组的卵块平均孵化数下降了 27.7%。对蚊虫干扰后卵的孵化率的检测发现,注射dsCppAK1组与对照孵化率一致,为89.9%,注射dsCppAK2组的孵化率降至85.0%,同时对CppAK1和CppAK2进行干扰,孵化率显著降低至59.9%,相比对照组降低了 33.3%。研究了 CppAK1和CppAK2对淡色库蚊吸血行为的影响。检测了未吸血与吸血后3日的雌蚊CppAK1和CppAK2相对表达量,结果显示吸血后雌蚊的CppAK1和CppAK2表达量显著提高。CppAK1在吸血前后表达量存在显著性差异。采用显微注射的方法对淡色库蚊未吸血的雌性成虫进行RNA干扰,结果表明:注射dsCppAK1和同时注射dsCppAK1、dsCppAK2组雌蚊的吸血响应时间显著增加,吸血率分别减少了 28.7%和35.4%,同时注射组吸血量降低了 63.5%。注射dsCppAK1和同时注射组雌蚊的饱血率也呈现相似变化,其中同时注射组雌蚊的饱血率下降约36.8%,体现出显著性差异。注射dsCppAK2的雌蚊吸血响应时间、吸血率、吸血量及饱血率与对照相比无显著差异。
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