22q11.2区域泌尿系统畸形关键致病基因的初步筛查目的泌尿系统畸形是临床常见的严重危害儿童健康的疾病，发病率约为1～8‰，在全部出生缺陷中占第17位，且呈原因未明的上升趋势。从机理上看，遗传因素在泌尿系统畸形的发生中很可能扮演重要角色。对其分子机理的深入研究将有助于揭示这类畸形的发生机制，并为设计早期基因诊断和遗传咨询提供依据。一些表达于肾脏发育早期的基因如PAX2、KAL、EYA1、AGTR2、HNF-1beta、SIX1、SiX2、SALL1、FOXC1、WT1、HOX11等已相继被证实与泌尿系统畸形有关。近年来，许多证据显示染色体22q11.2区微缺失与多种泌尿系统畸形存在强烈关联，具体异常涉及肾脏(如单肾、小肾、肾结石、肾发生不全、多囊肾、复肾、肾钙质沉着、肾积水、马蹄肾、肾盂重复、肾小管酸性中毒等)、输尿管／膀胱(如阻塞性异常、膀胱输尿管返流、不规则膀胱、膀胱壁增厚等)以及尿道下裂等。最近，Annegret等在6名22q11.2缺失携带者中发现5人(80％)存在肾脏发育不良如肾积水、单肾等。研究者提议，尽管上述病例发生肾脏异常的原因尚不清楚，但DGCR区(Digeorge综合征关键区域)内的一个或多个基因的缺陷很可能影响早期胚胎发育中泌尿生殖道的发育，并可能导致孤立性肾脏异常。对其进行克隆与鉴定，进而开展产前诊断，不仅可以避免患儿出生，也将为开发相关的防治方法提供重要依据。分子遗传学研究已将缺失的关键区缩小到一段长约3Mb的DNA片段内，但目前对于该区域内的基因与泌尿系统发育的联系尚不清楚。本实验首次荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)的方法，对泌尿系统畸形患者进行22q11.2区域的缺失筛查；同时对不同发育阶段的胚肾进行常见缺失区域基因(DGCR区)进行表达分析。由于直接研究人类胚胎肾较为困难，而小鼠基因与人类基因高度同源，且标本容易获得，因此选择小鼠作为研究DGCR区域基因表达分析的模型。选择胚肾发育的3个不同时间点以及成年肾，运用RT-PCR及生物信息学的手段进行表达分析。根据分析结果，在泌尿系统畸形患者中进行候选基因的突变筛查，以明确易感基因。方法一、泌尿系统畸形患者中22q11.2微缺失的检测采用饱和氯化钠法提取泌尿系统畸形患者及健康成年人静脉血标本DNA，通过紫外分光光度计检测确定其浓度及纯度。将健康成年人血标本DNA按梯度稀释成10倍、100倍及1000倍，用于绘制PCR反应的标准曲线；之后通过Real-time Q PCR方法进行缺失检测。二、人类染色体22q11.2位点DGCR区基因在小鼠胚肾中的表达取成年健康雌性昆明小白鼠10只，与成年健康雄性小白鼠交配。用检查脱落阴道栓方法确定雌鼠受孕时间，以观察到阴道栓脱落的时间为孕1天计算。分别取胚龄13、15、19日胎鼠，提取胎鼠的肾脏组织以及正常成年昆明小鼠的肾脏、脑、肝等新鲜组织，取材后立即液氮冻存备用。用TRIzol试剂分别提取上述组织的总RNA，用逆转录酶和Oligo(dT)引物反转录合成cDNA作为PCR反应的模板。目前所知的DGCR区域的所有基因见图1，在Genbank数据库中查找上述基因的小鼠同源基因。根据其外显子序列，用Primer5软件设计引物。此外，根据www.genecards.org/index.shtml．中基因的表达信息，查找基因表达最丰富的组织，用该组织的cDNA为模板，探索所设计引物的最适扩增条件后，再对要检测的标本进行扩增。RT-PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶分离，用Alphalmage2000自动成像仪(Alpha Innotech Corp．，San Jose，CA)摄影，用Fluorchem v2.0 Stand Alone软件分析RT-PCR产量，用生物信息学方法对测得数据进行聚类分析。三、泌尿系统畸形患者中SNAP29基因突变筛查根据基因表达分析，初步判断SNAP29基因在肾脏发育的过程中扮演重要角色。针对该基因的5个外显子分别设计PCR引物，通过直接测序法在泌尿系统畸形患者中对该基因的全部外显子进行突变筛查。实验结果一、微缺失的检测在30个泌尿系统畸形的患者中，未检测到22q11.2区域微缺失的存在。二、人类染色体22q11.2 DGCR区域基因在小鼠胚胎肾中的表达DGCR区域的35个基因中，对其中的29个设计了引物，进行PCR扩增。由于在进行PCR之前，将来源于胎鼠4个不同时间点肾脏的cDNA稀释到相同浓度，所以可以达到定量的目的，扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，经自动凝胶成像仪分析电泳条带灰度值。根据测量的灰度值，应用K-means方法对数据进行聚类分析，具体做法是：排除在4个时间点均无表达的基因(共9个)；对所测灰度值＞0的标本通过对数转变(log2)进行标准化。结果提示，存在表达的基因可分为6类，每类基因的表达具有相似的规律。表达分析提示，9个基因在各时间点均无表达；其余大部分基因表达水平较低，且在早期胚胎中无表达——仅4个基因(Pnutl1、Ranbp1、Ube213和Mapk1)在13天的胚胎肾中即出现表达，且Pnutl1、Ranbp1和Mapk1在选择的4个时间点均存在表达，且水平较高。4个基因(Cdc451、Hira、Snap29、Ube213)仅在一定发育阶段的胚肾中有表达。似乎可以初步推测，Cdc451、Hira、Snap29、Ube213可能在肾脏发育中扮演重要角色。三、泌尿系统畸形患者中SNAP29基因突变筛查表达分析结果结合文献报道，选择SNAP29基因在泌尿系统畸形患者中进行突变筛查。随机挑选泌尿系统畸形患者静脉血标本DNA10例，对该基因的5个外显子进行扩增，之后用直接测序法进行检测。测序结果提示，1例患者存在该基因第二外显子的多处突变，分别位于第5，6，9，40，44，48位密码子，其中第6密码突变为终止密码，使其翻译提前终止。结论1．应用real-time Q PCR技术对泌尿系统畸形患者22q11.2区域进行了微缺失检测。在30名患者中，未发现缺失携带者。2、首次对小鼠胚肾不同发育阶段DGCR区域全部基因进行表达分析，获得其在胚肾发育早期的表达资料。结合Kmeans聚类分析，对该区域基因在肾脏发育过程中的表达规律进行初步探索。初步判断Cdc451、Hira、Snap29、Ube213在胚肾发育中具有重要的功能。3、在泌尿系统畸形患者中对SNAP29基因进行了突变筛查，目前已发现1例截短突变。