无色杆菌JL9降解磺胺甲恶唑与好氧脱氮特性及机制研究

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Guihuaxuetu
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磺胺类抗生素(主要是磺胺甲恶唑)及其诱导产生的抗性基因(ARGs)已在多种环境介质中检出。在典型的畜牧养殖业废水、垃圾渗滤液中含有高浓度的磺胺类抗生素、NH4+-N和重金属等多种污染物,这类复合污染废水排入水体环境中,会造成生态与环境的破坏。采用生物法处理上述废水时,选育具有磺胺类抗生素降解、脱氮和重金属耐受型功能微生物是解决抗生素复合污染的关键策略。本研究通过长期驯化活性污泥中菌群,并采用筛选、分离、纯化等方法得到一株具有磺胺甲恶唑降解、好氧脱氮功能的菌株,并以该菌株为核心构建了复合污染废水微生物处理研究体系。采用微生物学、生物化学、分子生物学及生物动力学等手段,开展了功能菌的生理生化特性、污染物降解特性、降解动力学特性、降解途径和机理、氮转化机制、复合污染中抗生素降解特性及机理、悬浮填料生物膜反应器(MBBR)对模拟畜禽养殖废水多种抗生素的处理效能等研究。得到如下结果与结论:1、用制药废水处理厂以及工业废水处理厂好氧段活性污泥为种泥,通过富集、驯化、筛选、分离、纯化等手段筛选出一株具有磺胺甲恶唑降解协同好氧脱氮的纯种菌株JL9。通过比对,该菌株属于无色杆菌(Achromobacter.sp)。菌株JL9能够利用33种碳源,在好氧条件下菌株生长直接进入对数生长期。在菌株JL9中扩增得到基因片段长度为857 bp的好氧反硝化基因。2、菌株JL9对NO3--N和NH4+-N和总氮的去除率分别达到94.61%,87.07%和83.44%。此外,对总有机碳和磺胺甲恶唑的降解效率别为75.43%和91.60%。通过研究环境因素对磺胺甲恶唑降解和脱氮的影响规律可知,在C/N比3.0-5.0,磺胺甲恶唑浓度20-40 mg·L-1,溶解氧2-6 mg·L-1,初始p H 6.0-8.0,温度25-35 oC条件下,菌株JL9对磺胺甲恶唑和总氮具有较高的降解和脱除效率。磺胺甲恶唑降解和总氮脱除均符合一级动力学模型,最高速率常数分别为0.022 h-1和0.021h-1。正交实验响应分析结果表明在C/N比为6,摇床转速为148 rpm·min-1以及磺胺甲恶唑浓度为25.67 mg·L-1时,菌株JL9对磺胺甲恶唑的降解效率最高,将达到96.11%。菌株JL9的生长代谢及降解抗生素对碳源和氮源有较强的依赖,并且对碳源的依赖高于对氮源的依赖。磺胺甲恶唑的生物降解主要是由细胞内外酶以及生物膜上酶的协同作用结果,并且生物膜上外蛋白和酶对降解的贡献值最大。菌株JL9对磺胺甲恶唑降解的主要反应包括,磺胺S-N键裂解、异恶唑开环、苯环开环和羟基化。ECOSAR检测发现部分代谢化合物的毒性比磺胺甲恶唑高,但最终降解产物的毒性较低,由此可得以下结论:随着降解进行,溶液的生物毒性是逐渐降低的。3、菌株JL9对不同磺胺类抗生素均有一定的降解效果,但菌株对不同类抗生素的降解有选择性,其中对磺胺甲恶唑的降解效率最高,对甲氧苄啶有一定的降解效果,而对环丙沙星几乎没有降解作用。采用UHPLC-QTOF-MS对不同抗生素胁迫下菌株JL9的非靶标代谢特性进行检测,结果表明:磺胺甲恶唑、甲氧苄啶和环丙沙星的胁迫均未对菌株JL9中二氢叶酸和四氢叶酸合成和转换造成显著影响,而甲氧苄啶、环丙沙星和四环素的胁迫会导致氨酰-t RNA合成通路的改变。ABC转运蛋白,氨基酸的生物合成和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,以及Fc RI信号通路的富集结果均非常显著,以上富集通路的改变是菌株JL9的抗生素抗性以及对抗生素降解性能差异的主要原因。4、重金属离子会明显抑制菌株JL9的繁殖和对磺胺甲恶唑的降解活性。然而添加Mn(Ⅱ)能够提高菌株JL9的好氧脱氮以及磺胺甲恶唑降解效率,并且适当的Mn(Ⅱ)浓度还能够提高菌株JL9降解磺胺甲恶唑的稳定性和温度耐受性。当Mn(Ⅱ)为2 mg·L-1时,菌株JL9对磺胺甲恶唑降解、总氮去除和Mn(Ⅱ)氧化效率分别为95.43%,85.62%和85.78%。菌株JL9降解和生物锰氧化物(Bio Mn Ox)催化氧化对磺胺甲恶唑降解的贡献率分别为80.17%和15.54%,而对总氮去除的贡献率分别为85.45%和3.36%。在抗生素与锰复合污染中,菌株JL9降解磺胺甲恶唑的反应主要发生在异恶唑环、S-N键和氨基的位置,并且环境毒性的变化直接与微生物的共代谢反应相关,随重金属氧化和抗生素的去除,溶液中毒性显著降低。5、构建了菌株JL9强化MBBR系统处理模拟畜禽养殖废水。菌株JL9能够提高MBBR对污染物的去除效率,生物强化MBBR系统对磺胺甲恶唑、NO3--N和NH4+-N的最佳去除效率分别为80.49,94.70和95.38%。反应器运行中进水C/N比会影响抗生素抗性基因(ARGs)复制和传播概率,但对反应器出水的生物毒性影响不大。在C/N比3.0-6.0,初始pH 7.0,HRT 10 h条件下运行时,试验组中Achromobacter.sp属于生物膜上的优势菌种之一(相对丰度大于1.0%),而对照组中Achromobacter.sp并不是优势菌种。以上结果说明菌株JL9在生物强化MBBR系统降解各类污染中发挥了重要作用。6、菌株JL9强化MBBR对总氮的最大去除率为93.28%,对各类抗生素去除率分别为85.16%(磺胺甲恶唑,SMX)、65.34%(甲氧苄啶,TMP)、75.53%(四环素,TEC)和27.11%(环丙沙星,CIP)。分别在5 mg·L-1磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、四环素和环丙沙星胁迫下,生物强化MBBR对总氮的脱除率分别为93.28、79.78、84.42和77.48%,甲氧苄啶和环丙沙星会导致亚硝氮的大量累积,而四环素和环丙沙星会导致硝态氮的积累。抗生素胁迫所导致生物膜的破坏是可逆的,且不同抗生素的降解途径有相似之处,主要包括:开环、S-N键裂解、胺化、羟基化和甲基化等反应。不同抗生素胁迫下,生物膜上的抗生素抗性菌和脱氮功能菌的相对丰度逐渐会增加,如Paenarthrobacter,Plasticicumulans.sp,Pseudomonas.sp,Hydrogenophaga.sp,Thauera.sp和Rivibacter.sp。而部分功能菌和生物强化菌株(Achromobacter.sp和Nitrospira.sp)的相对丰度会随着不同抗生素胁迫而降低。以上研究结果为深入了解微生物降解磺胺类抗生素的研究提供了理论和技术基础及参考案例,还可为畜禽养殖废水和垃圾渗滤液的生物处理提供理论依据和技术支持。
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