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遗传性代谢病（inherited metabolic disorders.IMD）是由于编码物质代谢所必需的酶或者辅酶基因变异引起相应功能蛋白活性降低或丧失,从而导致机体代谢紊乱,最终引发复杂的临床症状,常累及神经系统等多器官的一组疾病。遗传性代谢病具有先天性、伴随终生的特点,并且遗传代谢病往往会对患儿的神经系统造成不可逆损伤,严重时危及生命。因此,早发现、早诊断、早治疗是目前公认的预防遗传代谢病危害的有效途径。本研究对甘肃地区286682名新生儿的遗传代谢病疾病谱和遗传图谱进行了分析,发现了 28种致病基因造成的23种遗传代谢病,总体遗传代谢病患病率为1/1593,其中,苯丙酮尿症（Phenylketonuria.PKU）患病率最高,为1/3083,随后为甲基丙二酸血症（Methylmalonic acidemia,MMA）（1/8959）、四氢生物蝶呤缺乏症（Tetrahydrobiopterin deficiency.BH4D）（1/15927）、希特林蛋白缺乏症（1/47780）、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（1/57336）、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症（1/95561）及枫糖尿病（1/95561）。本地区IMD总体患病率低于同为西北地区的陕西地区,但高于国内其他地区。推测这可能是由于西北地区经济水平欠发达,人口流动性有限,由于当地人群的建立者效应所致,但需要扩大样本量来进一步研究。本研究在在28个致病基因中共鉴定出166个致病变异,其中,13种遗传代谢病的16个基因上发现了 31个尚未报道的变异,丰富了遗传代谢病相关致病基因变异数据库,为本地区IMD精准筛查与诊断体系的建立提供基础性数据。本研究重点分析了甘肃地区高发的三种遗传代谢病的遗传图谱,分别为PKU、MMA及BH4D。发现PKU致病基因PAH的热点变异主要有c.728G＞A、c.611A＞G、c.721C＞T、c.1068C＞A、c.442-1G＞A、c.1238G＞C、c.1197A＞T（3.61%）、c.842+2T＞A、c.331 C＞T 等;MMA 致病基因MMACHC 热点变异有 c.609G＞A、c.567dupT、c.658660delAAG（8.82%）、c.80A＞G（5.88%）及 c.394C＞T（5.88%）等,BH4D 致病基因PTS基因热变变异主要为 c.259C＞T、c.286G＞A、c.200C＞T、c.272A＞G、c.402A＞C等。这些基因的热点变异的结果可为本地区今后开展大规模新生儿基因筛查提供基础性数据。本研究是国内单一地区最大样本量的PKU研究,通过Sanger测序技术、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）、全外显子组测序（whole exome sequencing,WES）技术对PKU患者进行了基因分型,本研究PAH基因的等位基因检出率及PKU基因诊断率相对于以往的研究均较高,但仍有4.8%的PKU患者未得到明确的基因诊断。为了进一步提高PKU患者的基因诊断率,本研究首次分析了PAH基因的深部内含子变异情况,通过WGS、PAH基因全长测序及minigene技术发现了PAH基因5个深部内含子致病性变异,从而进一步提高了 PKU的基因诊断率。其中,c.1199+502A＞T位点在18个患者中被检测到,本研究推测,该位点可能是一个深部内含子区的热点变异位点。为了验证PAH基因深部内含子变异c.1199+502A＞T的致病性,本研究采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组的方式,在Pah基因exon11-12位点定点敲入PAH exon11-12（c.1 199+502A＞T）表达框,获得纯合变异小鼠对c.1 199+502A＞T位点的致病性进行了表型模拟。通过串联质谱检测对小鼠血苯丙氨酸（phenylalanine,Phe）进行了检测,结果显示纯合变异小鼠血Phe含量明显高于野生型与杂合子小鼠。通过小鼠表型观察,本研究构建的Pah基因c.1199+502A＞T小鼠纯合变异模型表现出经典型苯丙酮尿症的表型,包括生长发育迟缓、毛发发黄等症状。当然,本部分研究仍然存在一定的局限性,今后需继续开展c.1199+502A＞T野生型人源化小鼠研究来进一步确认PAH基因c.1199+502A＞T位点的致病性。尽管如此,本研究为苯丙酮尿症的发病机制研究及治疗研究提供了新的经典型PKU小鼠模型,也为今后开展对深部内含子变异的致病性研究提供了一定的参考依据。