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【目的】
1.观察psrA基因对黏液型铜绿假单胞菌体外生物性状的影响。
2.比较psrA基因、PA2815基因对铜绿假单胞菌生物性状的影响。
【方法】
构建psrA基因敲除株：PA64/ΔpsrA株。通过血平板培养，观察64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株体外生物性状的改变，并进行检测：①使用比浊法测定铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株三株菌的生长曲线；②使用氯仿萃取法测定铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株绿脓菌素的含量；③使用一次性吸痰管结合9孔板结晶紫染色法测生物膜含量，分别于1d、3d、5d、7d半定量检测铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株生物膜生成量；④使用一次性吸痰管结合硫酸/四硼酸钠法，分别于1d、3d、7d半定量检测铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株生物膜中藻酸盐的含量；⑤脂肪酸试验检测铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株利用长链脂肪酸的效率。
【结果】
1.成功构建带有Gm抗性基因的黏液型铜绿假单胞菌64菌株psrA基因敲除株：PA64/ΔpsrA。
2.细菌培养、革兰氏染色及微生物质谱仪结果：经哥伦比亚血琼脂平板培养24h后肉眼观察，64野生株生长较慢，尚未看到平板有菌落。PA2815敲除株菌落平滑，黏液少；psrA敲除株光滑平整，粘液和色素少。经光学显微镜(油镜)观察，野生株与敲除株均为革兰染色阴性菌。微生物质谱仪鉴定psrA敲除株为铜绿假单胞菌。48h后，64野生株菌落大且分散，产生色素与粘液。PA2815敲除株菌落平滑，体积大，黏液少；psrA敲除株菌落光滑平整，体积变大，粘液少，色素多。
3.生长曲线的测定：三株菌在4小时后进入对数生长期，之后psrA敲除株的生长速度一直较PA2815敲除株和原株快。15小时后三株菌都到达稳定期。
4.绿脓菌素的测定：两株敲除株分泌绿脓菌素的能力明显高于野生株(P＜0.05)，PA2815敲除株绿脓素含量大约是野生株的6倍，psrA敲除株分泌绿脓菌素的能力是野生株的3倍。
5.生物膜半定量检测：刚开始三株菌形成生物膜的量十分接近，64野生株在第4天后产生生物膜的量明显最多。psrA敲除株次之，PA2815敲除株形成的量最少。
6.生物膜中藻酸盐含量的测定：三株菌株生长变化较为接近，在第4天后64野生株形成藻酸盐的量最多，psrA敲除株次之，PA2815敲除株形成的量最少。
7.脂肪酸试验检测PA2815敲除株与64野生株两株菌利用长链脂肪酸的效率：在含有油酸盐的培养基中，64野生株与PA2815敲除株提前进入对数生长期，并且生长趋势快，更早进入生长后期。而不含油酸盐的培养基中，64野生株与PA2815敲除株进入对数生长期较晚，并且生长速度慢。
【结论】
1.psrA基因可以正向调控黏液型铜绿假单胞菌的生长，生物膜的形成和藻酸盐的分泌；负向调控绿脓菌素的分泌。
2.PA2815提高铜绿假单胞菌对长链不饱和脂肪酸的利用率。
1.观察psrA基因对黏液型铜绿假单胞菌体外生物性状的影响。
2.比较psrA基因、PA2815基因对铜绿假单胞菌生物性状的影响。
【方法】
构建psrA基因敲除株：PA64/ΔpsrA株。通过血平板培养，观察64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株体外生物性状的改变，并进行检测：①使用比浊法测定铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株三株菌的生长曲线；②使用氯仿萃取法测定铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株绿脓菌素的含量；③使用一次性吸痰管结合9孔板结晶紫染色法测生物膜含量，分别于1d、3d、5d、7d半定量检测铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株生物膜生成量；④使用一次性吸痰管结合硫酸/四硼酸钠法，分别于1d、3d、7d半定量检测铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株、psrA敲除株生物膜中藻酸盐的含量；⑤脂肪酸试验检测铜绿假单胞菌64野生株、PA2815敲除株利用长链脂肪酸的效率。
【结果】
1.成功构建带有Gm抗性基因的黏液型铜绿假单胞菌64菌株psrA基因敲除株：PA64/ΔpsrA。
2.细菌培养、革兰氏染色及微生物质谱仪结果：经哥伦比亚血琼脂平板培养24h后肉眼观察，64野生株生长较慢，尚未看到平板有菌落。PA2815敲除株菌落平滑，黏液少；psrA敲除株光滑平整，粘液和色素少。经光学显微镜(油镜)观察，野生株与敲除株均为革兰染色阴性菌。微生物质谱仪鉴定psrA敲除株为铜绿假单胞菌。48h后，64野生株菌落大且分散，产生色素与粘液。PA2815敲除株菌落平滑，体积大，黏液少；psrA敲除株菌落光滑平整，体积变大，粘液少，色素多。
3.生长曲线的测定：三株菌在4小时后进入对数生长期，之后psrA敲除株的生长速度一直较PA2815敲除株和原株快。15小时后三株菌都到达稳定期。
4.绿脓菌素的测定：两株敲除株分泌绿脓菌素的能力明显高于野生株(P＜0.05)，PA2815敲除株绿脓素含量大约是野生株的6倍，psrA敲除株分泌绿脓菌素的能力是野生株的3倍。
5.生物膜半定量检测：刚开始三株菌形成生物膜的量十分接近，64野生株在第4天后产生生物膜的量明显最多。psrA敲除株次之，PA2815敲除株形成的量最少。
6.生物膜中藻酸盐含量的测定：三株菌株生长变化较为接近，在第4天后64野生株形成藻酸盐的量最多，psrA敲除株次之，PA2815敲除株形成的量最少。
7.脂肪酸试验检测PA2815敲除株与64野生株两株菌利用长链脂肪酸的效率：在含有油酸盐的培养基中，64野生株与PA2815敲除株提前进入对数生长期，并且生长趋势快，更早进入生长后期。而不含油酸盐的培养基中，64野生株与PA2815敲除株进入对数生长期较晚，并且生长速度慢。
【结论】
1.psrA基因可以正向调控黏液型铜绿假单胞菌的生长，生物膜的形成和藻酸盐的分泌；负向调控绿脓菌素的分泌。
2.PA2815提高铜绿假单胞菌对长链不饱和脂肪酸的利用率。