背景与目的： 动脉粥样硬化严重危害着人类健康，是目前世界上引起人口死亡的首位原因，寻找抑制其进展的有效手段意义重大!血管平滑肌细胞的增殖和迁移是动脉粥样硬化的关键事件。动脉粥样硬化的过程中，血管壁长期处于慢性炎症反应中，产生多种细胞因子、生长因子等，如血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，血管平滑肌细胞在这些因子的刺激下，自血管中膜迁移至内膜并大量增殖。平滑肌细胞的这些生物学行为加重血管壁的增厚、管腔狭窄。因此，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移对控制动脉粥样硬化进展是非常重要的。 磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)是核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)超家族的成员之一，能够选择性降解第二信使cAMP。该超家族中PDE4家族的抑制剂被证明能够抑制上述的平滑肌细胞的增殖和迁移，其亚型PDE4D可能在其中发挥了重要作用；此外，2003年，冰岛科学家对冰岛居民进行了全基因组扫描和后续的人类脑卒中病例对照研究，发现PDE4D基因与缺血性脑卒中相关，并在文中分析PDE4D可能通过动脉粥样硬化参与了脑卒中的发病机制。因此抑制PDE4D可能对平滑肌细胞的增殖、迁移及动脉粥样硬化有一定控制作用。众多研究证实升高细胞内第二信使cAMP的水平能够抑制平滑肌细胞增殖、迁移，而cAMP又是PDE4D的唯一底物，所以，如果抑制PDE4D能够控制平滑肌细胞增殖、迁移的话则很可能是通过调节cAMP来实现的。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指多种生物体细胞内，内源性或外源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)触发同源mRNA的降解，进而发生序列特异性的转录后基因沉默的现象。该现象自从1998年被Fire发现以来迅速发展，成为备受人们青睐的重要研究工具。应用RNAi能够选择性地抑制某一特异的基因，降低其编码的蛋白的表达。在RNAi中，相对于直接转染或者其它载体，慢病毒载体能作用于非分裂相细胞、转染效率高、生物安全性好、宿主排斥反应小、可转移较大的目的片段、能够将小干扰RNA(small interferentialRNA，siRNA)整合入目的细胞的基因组内长期表达，因此近年来得到越来越多的应用。利用慢病毒介导的RNAi技术特异性地降低细胞中PDE4D的表达，建立对血管平滑肌细胞增殖、迁移的体外干预体系，并研究其干预机制，将为进一步的深入研究以及下一步体内实验提供重要的参考依据，意义深远。 本研究拟构建PDE4D-shRNA慢病毒，研究其对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖、迁移能力的影响并初步探讨其可能机制。 材料与方法：1.细胞培养及组别设置实验中所用到的细胞包括细胞株293T细胞和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC)，以及自SD大鼠胸主动脉取材的平滑肌细胞(aorta smooth muscle cell，ASMC)；各自用专门的培养基培养。实验设置空白对照组(CON，control)、阴性对照组(NC，negative control)和敲减组(KD，knockdown)，在目的细胞ASMC中进行的功能学实验共设置CON、CON+PDGF、NC、NC+PDGF、KD、KD+PDGF六个组。 2.PDE4D-shRNA慢病毒的构建2.1 shRNA-pGCL-GFP重组质粒的构建及鉴定针对目的基因PDE4D，利用Ambion网站的shRNA设计软件，选择4个靶点设计合成4对shRNA，PAGE凝胶电泳检测双链形成效率，连接入慢病毒载体系统的载体质粒pGCL-GFP，用PCR和测序的方法进行鉴定。 2.2 RNAi慢病毒颗粒的包装、浓缩及滴定应用293T细胞包装慢病毒颗粒，即将上述构建好的shRNA-pGCL-GFP重组质粒由慢病毒载体系统的包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0包装；包装好的慢病毒进行浓缩以提高病毒滴度，然后进行滴度测定。 　　3.筛选有效靶点应用Real-time PCR和Western blot的方法检测各个靶点的shRNA在mRNA水平和蛋白水平对PDE4D的敲减情况，筛选敲减效率最高的靶点。 4.检测有效靶点shRNA在平滑肌细胞中对目的基因的干扰作用有效靶点shRNA慢病毒转染目的细胞，大鼠胸主动脉平滑肌细胞，应用Real-time PCR和Western blot的方法检测该shRNA在其中对PDE4D的敲减效率。 5.平滑肌细胞增殖能力的检测应用细胞计数法和MTT法两种方法检测平滑肌细胞的增殖能力，确定慢病毒介导的RNAi敲减PDE4D对平滑肌细胞增殖能力的影响。 6.平滑肌细胞迁移能力的测定应用Transwell的方法检测敲减PDE4D对平滑肌细胞迁移能力的影响。 7.放射免疫法检测细胞内cAMP水平采用经典的放射免疫法检测平滑肌细胞内cAMP的水平，初步探讨敲减PDE4D对平滑肌细胞增殖、迁移能力影响的可能机制。 8.统计学方法实验数据应用SPSS12.0统计软件进行分析，各组之间的比较采用方差分析，两两组间比较采用SNK的方法，检验水准α=0.05。 结果： 1.PAGE凝胶电泳检测目的片段双链形成效率PAGE凝胶电泳法检测所设计合成的4对shRNA，证明双链退火正确。 2.重组质粒的鉴定2.1 PCR鉴定连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：350bp：没有连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：299bp。凝胶电泳显示连接正确，进一步行测序检测。 2.2重组质粒测序经测序证明PDE4D基因shRNA的双链核苷酸正确插入pGCL-GFP载体中，插入序列无突变、缺失，位置及片段大小正确，shRNA-pGCL-GFP载体构建成功。 3.病毒滴度测定所得浓缩病毒液的滴度为5×108TU/ml。 4.筛靶 4.1 Real-time PCR筛靶Real-time PCR结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比较，2＃，3＃，4＃靶点均敲减了目的基因，具有统计学意义，其中2＃靶点敲减效果最好。 4.2 Western Blot筛靶结果在蛋白水平，各靶点shRNA慢病毒转染目的细胞后PDE4D蛋白表达均有不同程度的下降，其中2＃靶点的敲减效率最高，与mRNA水平结果一致。 5.血管平滑肌细胞的培养及鉴定5.1细胞形态学观察自SD大鼠胸主动脉分离的平滑肌细胞大小均一，呈典型的“峰与谷”样生长。 5.2平滑肌细胞的鉴定用免疫细胞化学的方法对分离培养的细胞进行α-actin鉴定，结果为阳性。 6.有效靶点shRNA在目的细胞中对目的基因干扰效率的验证6.1慢病毒转染目的细胞筛选出的有效靶点shRNA慢病毒转染目的细胞ASMC，荧光镜检，转染效率达95％以上。 6.2 Real-time PCR检测有效靶点shRNA对目的基因的敲减效率Real-time PCR显示ASMC转染PDE4D-shRNA慢病毒后，其PDE4D在mRNA的表达水平比未敲减组降低了70％以上，p<0.05，NC组表达水平没有明显下降。 6.3 Western Blot检测有效靶点shRNA对目的基因表达的抑制效果结果显示有效靶点shRNA明显降低ASMC中PDE4D的蛋白表达水平，敲减效率可以达到70％以上，p<0.05，而NC组与CON组没有统计学差异。 7.平滑肌细胞的增殖能力的测定细胞计数法及MTT法均显示：PDGF组细胞的增殖能力明显强于非PDGF组，p<0.05；PDGF+KD组与其它组相比，细胞增殖能力低于PDGF组但高于未加PDGF组，差异具有统计学意义。 8.Transwell法检测平滑肌细胞的迁移能力未加PDGF组细胞的迁移能力明显较PDGF组低，即PDGF诱导了ASMC的迁移，p<0.05；PDGF+KD组迁移的细胞数较未敲减PDE4D的PDGF组有降低，但与未加PDGF组相比仍然有增高，p均小于0.05。 9.平滑肌细胞中cAMP的水平放射免疫法检测平滑肌细胞中cAMP的水平，结果显示，PDGF组与未加PDGF组相比，细胞中cAMP的水平有所升高，差异具有统计学意义，p<0.05；但其余组未发现统计学差异。 结论： 1.成功构建了PDE4D-shRNA慢病毒，在大鼠胸主动脉平滑肌细胞中对目的基因的敲减效率在mRNA水平和蛋白水平均达到70％以上。 2.敲减PDE4D可以抑制PDGF诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞的增殖和迁移。 3.敲减PDE4D对PDGF诱导的平滑肌细胞增殖和迁移的抑制作用并非通过改变细胞中cAMP的整体水平来实现的。